影响核酸泳动距离的因素有哪些

1、核酸的性质

核酸的电荷量，分子大小，分子的空间构象等决定了不同的核酸分子具有不同的迁移率。对于线状双链DNA分子，在凝胶电泳中，分子量的常用对数与泳动 率成反比关系，一般双链DNA基本上不存在影响迁移率的复杂构象，但分子的空间构象也影响泳动速率，如分子量相同的质粒DNA 迁移速率则是：闭环型>线性>单链开环型。

对于单链RNA或DNA，其在凝胶电泳中的迁移率受碱基组织和序列的影响，同等大小的核酸可能由于空间构象不同而使迁移率不同，故可利用变性凝胶电 泳分离纯化单链核酸。

2、凝胶孔径的大小：

琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶（polyacrylamide gel， PAG）是核酸凝胶电泳常使用的支持材料，通过两种支持介质的浓度变化调整所形成凝胶的分子筛网孔大小，能分离不同分子量的核酸片段，琼脂糖凝胶的孔径大，分辨率低，但分离范围广，约100bp~50kb的DNA；PAG的孔径小，分离小片段 （5~500bp）DNA效果较好，甚至可以分辨相差1bp的DNA片段。凝胶孔径的大小是影响核酸在凝胶电泳中迁移率的最基本因素，它决定了能被分离的 片段的大小。下表列出不同凝胶浓度与其分离DNA分子大小的范围。

凝胶

胶浓度（%）

线状DNA分子的有效分离范围

溴酚兰

琼脂糖

03

5~60 (kb)

07

08~10

09

05~7

12

04~6

15

02~4

20

01~3

PAG

35

100~2000 (bp)

100

50

80~500

65

80

60~400

45

120

40~200

20

150

25~150

15

200

6~100

12

指迁移率与染料相同的双链DNA片段的粗略大小（核苷酸对）

3、电场强度和电场方向：

低电压时，线状DNA片段的电泳迁移率与所加的电压成正比，通常凝胶电泳的电场强度不超过5V/cm凝胶。随电场强度增加，高分子量的DNA片段的 迁移率将以不同的幅度增加，使凝胶的有效分离范围缩小。对于大分子量真核基因组DNA片段的电泳常采用05~10V/cm电泳过夜，以取得较好的分辨 力和整齐的带型。如果电场呈周期性变化，各种分子量的DNA片段为适应新的电场变化所需的时间将不同，分子量越大，则所需的时间越多。因此可以通过脉冲电 场凝胶电泳分离极大片段的DNA。

4、电泳环境

缓冲液的组成和离子强度直接影响迁移率。Tris-Cl缓冲体系中，由于Cl－的泳动速度比样品分子快得多，易引起带型不均一现象，所以常采用含EDTA的Tris-醋酸（TAE）、Tris-硼酸（TBE）和Tris-磷酸（TPE）三种缓冲体系。传统最常用的是TAE，但其缓冲能力很低，长时间电泳需要正、负电极贮 液槽之间进行缓冲液循环，并经常更新TAE。TBE与TPE有较高的缓冲能力，现多用，但因TBE中硼酸易与琼脂糖形成复合物，在短时间（≤5h）琼脂糖凝胶电泳时，常用TAE，而在PAGE中常用TBE。双链线状DNA在TAE中迁移速率比TBE或TPE 中快将近10%，但各个缓冲体系的分辨能力几乎相同，（对超螺旋DNA，在TAE 中的分辨率比在TBE中的更好）。凝胶电泳后要回收DNA片段，不宜采用TPE缓冲体系，这使DNA片段含较高的磷酸盐、易与DNA一起沉淀，而影响一些 酶反应，缓冲液中含EDTA，目的在于螯合二价离子，抑制核酸酶以保护核酸。

缓冲液的离子强度与样品泳动速度成反比，电泳的最适离子强度一般在002~02之间。在高速离子强度下（如误加10×电泳缓冲液），溶液导电性 极高并明显产热，可能引起凝胶熔解及DNA变性。

缓冲液的pH值影响DNA迁移率，溶液的pH值远离样品等电点时，样品荷电量越多，泳动越快，核酸电泳液常用偏碱性或中性条件，使核酸带负电荷，向 正极泳动。

在进行电泳时，荧光染料EB可插入到碱基中，从而增加线状和开环DNA的长度，使其刚性更 强，并会使线状DNA的迁移率降15%，另外温度和碱基堆积也会影响DNA的迁移率。

常用的核酸染料有:

1、EB染料

EB属于核酸分子嵌入剂，通常用于分子遗传学、DNA和染色质结构分析等研究中，特别是国内很多实验室仍在使用EB进行凝胶核酸电泳实验的染色。

EB是极易渗透细胞膜与胞内DNA嵌合的小分子，它具有平面共轭大环结构，是典型的DNA

分子插入试剂，菲啶环插入到DNA分子的碱基对之间，与DNA嵌合形成稳定的复合物，并影响DNA

的复制，破坏正常的遗传生理现象。EB作为诱变性的化合物，它在人体中诱导突变的机制是不可逆转的。

2、GoldView染料

GoldView(GV)是一种可代替溴化乙锭（EB）的新型核酸染料，其灵敏度与EB相当，使用方法与之完全相同。在紫外透射光下双链DNA呈现绿色荧光，也可用于RNA染色。

实质上，所谓的Goldview就是吖啶橙，也就是传说中的AO，有一种传统的细胞凋亡试验，采用的染料正是吖啶橙，也就是AO/EB染色试验，EB无法穿透完整的细胞膜，而AO可以穿过细胞膜染上细胞核，以此来区分凋亡和未凋亡的细胞。

3、GelRed 和 GelGreen染料

GelRed

和GelGreen

是两种集高灵敏、低毒性和超稳定于一身的极佳的荧光核酸凝胶染色试剂。其水溶染色剂通过美国环保局安全认定，废弃物可直接倒入下水道，而不会造成任何环境污染。

GelRed

和 GelGreen

的特殊化学结构使其难以穿透细胞膜进入细胞，正是这一特性降低了染料的细胞毒性。不过也正是因为如此，其价格大约是GoldView的十倍左右。

扩展资料

核酸染料的科研应用：

1、免疫分析

荧光标记的单克隆抗体技术为流式细胞仪在研究细胞膜和细胞内各种功能性抗原、肿瘤基因蛋白等领域扩展了无限的应用空间。

荧光探针可以通过蛋白质交联剂共价结合在单克隆抗体上。免疫荧光标记最常用的染料有异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate, FITC)、藻红蛋白（PE）以及AlexaFluor系列染料等。

2、核酸检测

核酸荧光染料对细胞核染色后定量测量细胞所发出的荧光强度，就可以确定细胞核中DNA、RNA的含量，并可以对细胞周期和细胞的增殖状况进行分析。

有多种荧光染料可以对细胞中的DNA或RNA染色，常用的DNA染料包括碘化丙啶(PI)、DAPI、Hoechst 33342等，RNA染料有噻唑橙、吖啶橙等。

-荧光染料

核酸分子是两性解离分子，在高于其等电点的电泳缓冲液中，其碱基不解离，而磷酸基团全部解离，核酸分子因而带负电荷，电泳时向正极迁移。琼脂糖主要从海洋植物琼脂中提取而来并经糖基化修饰，为一种聚合链线性分子，使用琼脂糖凝胶作为电泳支持介质，发挥分子筛功能，使得大小和构象不同的核酸分子的迁移率出现较大差异，从而达到分离的目的。琼脂糖凝胶电泳操作简单、快速，通过调整其使用浓度，使得分辨率达到大多数实验的要求，因此成为分离、鉴定、纯化核酸分子的常用方法。但操作过程中仍有不少要注意的问题。

1 凝胶制作

1．1 凝胶浓度 配制凝胶的浓度据实验需要而变 ，一般在0．8％ ～2．0％之间，如果一次配制凝胶100 ml，没用完的凝胶可以再次融化，但随着融化次数的增加，水分丢失也越多，凝胶浓度则会越来越高，导致实验结果不稳定，补水办法：一是在容器上标记煮胶前的刻度，煮胶后补充相应的水分至原刻度；二是在煮胶前称重，煮胶后补充水至原重量。粗略一点的方法是通过多次较恒定的煮胶条件得出一个经验补水值。以保证凝胶浓度基本维持在原浓度。核酸染色剂溴化乙锭(ethidium bromide)可加在融化的琼脂糖中，终浓度为0．5 tg／ml；也可在电泳结束后染色。

1、2 梳板的选用 一般每个制胶模具均配有多个齿型不同的梳板，梳齿宽厚，形成的点样孑L容积较大，用于DNA 片段回收实验等；相反，梳齿窄而薄，形成的点样孑L容积就较小，用于PCR产物、酶切产物鉴定等。梳板的选择主要是看上样量的多少而定，一般来说，上样量小时尽量选择薄的梳板制胶，此时电泳条带致密清晰，便于结果分析。另外，每次制胶时都要注意梳齿与底板的距离至少要1 mm，否则，拔梳板时易损坏凝胶孑L底层，导致点样后样品渗漏。当然，点样孑L的破坏还与拔梳板的时间和方法有关，一般凝胶需冷却30 min以上方可拔梳板，应急的情况下可以将成型的凝胶块放4℃ 冰箱中冷却15 min 左右，拔梳板的方法是将制胶槽放置在电泳槽中的电泳缓冲液中，然后垂直向上慢慢用力，因为有液体的润滑作用，梳板易拔出且不易损坏点样孑L。

2 点样

点样需加上样缓冲液，因为上样缓冲液中加了甘油或蔗糖增加密度，使样品沉入孑L底；指示样品的迁移过程，上样缓冲液中一般加了两种指示剂，溴酚兰和二甲苯青(值得注意的是指示剂并非染色剂，DNA染色剂是溴化乙锭，而且要在紫外光的激发下才能看见桔红色荧光)。上样缓冲液储存液一般为6× (10×)，表示其浓度为工作浓度的六倍。使用时上样缓冲液应稀释到一倍浓度。点样方法是将移液器基本垂直点样孑L，用另一只手帮助固定移液器下端，移液器枪头(Tip)尖端进入点样孑L即可将样品注入孑L内，千万不可将Tip尖插至孑L底，并点上适合的DNA分子量标准，所谓适合是指样品DNA分子量大小应基本在DNA分子量标准范围之内。

3 电泳

将电泳仪的正极与电泳槽的正极相连，负极与负极相连，核酸带负电荷，从负极向正极移动。电泳槽中电泳缓冲液与制胶用电泳缓冲液应相同，电泳缓冲液刚好没过凝胶1 mm 为好，电泳缓冲液太多则电流加大，凝胶发热。电泳时凝胶上所加电压一般不超过5 v／cm(指的是正负电极之间的距离，而不是凝胶的长度)，电泳时间一般为3O～60 min，根据实验需要也可作适当调整，电压增高，电泳时间缩短，核酸条带相对来说不够整齐，不够清晰；相反，电压降低，电泳时间较长，核酸条带整齐清晰。另外，如果电泳后样品泳动很慢或者没泳动，请检查胶模两端的封口胶条是否已去掉。

4 结果分析

较成功的电泳结果是分子量标准条带整齐清晰，样品条带也整齐清晰，如果条带模糊暗淡，单从琼脂糖凝胶电泳角度来说，可能的原因：溴化乙锭的质和量怎样溴化乙锭见光易分解，母液配制时间过长或保存不当(一般4℃ 避光保存一年内有效)，或者终浓度没达到0．5 vg／ml；电泳槽中缓冲液使用次数过多，缓冲能力下降。特别是TAE缓冲液，一般用2～3次就要更换，TBE缓冲液则可使用10次左右。

实际工作中经常发现DNA 分子量标准小片段模糊不清，那足因为琼脂糖凝胶浓度一般不会超过2 0％ ，较小的核酸片段在它的分辨范围之内，并且EB带正电荷，电泳时会向负傲移动，如果将凝胶置含EB(0．5#g／m1)的水溶液中30 min，较小的片段则可重新染色：另外，溴化乙锭(EB)是一种中等强度诱变剂，操作过程中要戴手套，并将加有EB的染色液作好标记、妥善保存

核酸胶浓度及dna大小有关系。

核酸胶浓度是指在核酸电泳实验中，用于检测和分析DNA或RNA样品浓度的胶液浓度。核酸胶包括琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶，其浓度以百分比或克/升来表示。DNA大小指DNA分子的长度或碱基对数目。DNA分子的大小可以通过核酸电泳实验中的DNA标准品或分子量标记来估算。

核酸胶浓度和DNA大小在核酸电泳实验中都起着重要的作用。