常用的蛋白质分离纯化方法有哪几种？各自的作用原理是什么

　　常用的蛋白质纯化方法有离子交换色谱、亲和色谱、电泳、疏水色谱等等

离子交换色谱：蛋白质和氨基酸一样会两性解离，所带电荷决定于溶液pH。pH小于pI时蛋白质带正电，pH大于pI时蛋白质带负电。不同蛋白质等电点的蛋白质在同一个溶液中，表面电荷情况不同。离子交换就是利用不同蛋白质在同一溶液中表面电荷的差异来实现分离的。

亲和色谱：生物大分子有一个特性，某些分子或基因对它们有特异性很强的吸附作用。如镍柱中Ni可以与His标签的蛋白结合，这种只针对一种或一类物质的吸附就是亲和色谱的原理。

电泳：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，SDS能断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构，强还原剂能使半胱氨酸之间的二硫键断裂，蛋白质在一定浓度的含有强还原剂的SDS溶液中， 与SDS分子按比例结合，形成带负电荷的SDS-蛋白质复合物，这种复合物由于结合大量的SDS，使蛋白质丧失了原有的电荷状态形成仅保持原有分子大小为特征的负离子团块，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异，由于SDS与蛋白质的结合是按重量成比例的，因此在进行电泳时，蛋白质分子的迁移速度取决于分子大小。

疏水色谱：疏水色谱基于蛋白质表面的疏水区与介质疏水配体间的相互作用，在高浓度盐作用下，蛋白质的疏水区表面上有序排列的水分子通过盐离子的破坏被释放，裸露的疏水区与疏水配体相互作用而被吸附。疏水色谱就是利用样品中各组分在色谱填料上配基相互作用的差异，在洗脱时各组分移动速度不同而达到分离的目的。随着盐离子浓度的降低，疏水作用降低，蛋白质的水化层又形成，蛋白质被解吸附。

分离蛋白质混合物的各种方法主要是根据蛋白质在溶液中的以下性质：1）分子大小；2）溶解度；3）电荷；4）吸附性质；5）对其它分子的生物学亲和力等进行分离。

常见的分离提纯蛋白质的方法有：

1、盐析与有机溶剂沉淀：在蛋白质溶液中加入大量中性盐，以破坏蛋白质的胶体性质，使蛋白质从溶液中沉淀析出，称为盐析。常用的中性盐有：硫酸铵、氯化钠、硫酸钠等。盐析时，溶液的pH在蛋白质的等电点处效果最好。凡能与水以任意比例混合的有机溶剂，如乙醇、甲醇、丙酮等，均可引起蛋白质沉淀。2、电泳法：蛋白质分子在高于或低于其pI的溶液中带净的负或正电荷，因此在电场中可以移动。电泳迁移率的大小主要取决于蛋白质分子所带电荷量以及分子大小。3、透析法：利用透析袋膜的超滤性质，可将大分子物质与小分子物质分离开。4、层析法：利用混合物中各组分理化性质的差异，在相互接触的两相（固定相与流动相）之间的分布不同而进行分离。主要有离子交换层析，凝胶层析，吸附层析及亲和层析等，其中凝胶层析可用于测定蛋白质的分子量。5、分子筛：又称凝胶过滤法，蛋白质溶液加于柱之顶部，任其往下渗漏，小分子蛋白质进入孔内，因而在柱中滞留时间较长，大分子蛋白质不能进入孔内而径直流出，因此不同大小的蛋白质得以分离。6、超速离心：利用物质密度的不同，经超速离心后，分布于不同的液层而分离。超速离心也可用来测定蛋白质的分子量，蛋白质的分子量与其沉降系数S成正比。

　　蛋白质的性质

1两性电离和等电点

氨基酸在等电点时,静电荷为零当蛋白质分子上的正负电荷相等时,这是溶液的PH称为蛋白质的等电点蛋白质等电点一般偏属酸性不同蛋白质的电泳速度和方向不同,因此可用电泳法把蛋白质从混合液中分离出来蛋白质分子含有大量酸性和碱性基团,因此蛋白质溶液对于酸碱都具有强大的缓冲能力

2凝胶与膨润

凝胶作用：在一定条件下,使高分子溶质或胶体粒子相互连接,形成空间网状结构,而溶剂小分子充满在网架的空隙中,成为失去流动性的半固体状体系,称为广义凝胶,这种凝胶化过程称为凝胶

蛋白质的凝胶化作用是指变性的蛋白质分子聚集并形成有序的蛋白质网络结构过程蛋白质凝胶化由于蛋白质分子中氢键、疏水作用、静电作用、金属离子的交联作用、二硫键等相互作用的结果

蛋白质凝胶可以看成是水分散在蛋白质中的一种胶体状态,可以含有大量的水（如明胶可含水99%以上）,具有一定的形状和弹性,具有半固体的性质（肌肉组织中,蛋白质的凝胶状态是肌肉能保持大量水分的主要原因）应用：果冻、豆腐香肠、重组肉制品、乳品、凝结蛋白、明胶凝胶不仅形成固态凝结还能增稠,提高乳状液或泡沫的稳定性

膨润作用：当弹性凝结和溶剂接触时,便自动吸收溶剂而膨胀,体积增大,这个过程叫膨润或溶胀有点弹性凝胶膨润到一定程度体积增大就停止了,称为有限膨润如：木材在水中有的弹性凝胶能无限的吸收溶剂最后形成溶液,叫无限膨润如：明胶在水中

3沉淀作用

蛋白质稳定因素：1水化作用2电荷

可逆沉淀：指用无机离子使蛋白质分子失去电荷或用有机溶剂使蛋白质分子脱水,造成蛋白质分子沉淀盐析

不可你性沉淀：指用化学方法（重金属《条件偏碱性》、生物碱试剂或某些酸类）或物理方法（加压、加热和光照）是蛋白质发生永久性变性而形成的蛋白质分子的沉淀

4蛋白质变性

是指蛋白质受到外界物理或化学因素的作用是蛋白质的物理、化学和生物学性质发生改变主要是空间结构发生改变,可逆：三四级变,不可逆：二级也变

变性后特点：溶解度降低、生物活性丧失、易被酶水解

影响因素：物理：紫外照射、加热煮沸、剧烈震荡、加压、超声波、射线照射等

化学：强酸强碱、乙醇、丙酮等有机溶剂、重金属、盐类等

5蛋白质水解

蛋白质加酸、碱、或酶后经过一系列的加水分解作用,最后被分解成氨基酸,这个化学变化过程是蛋白质的水解过程

蛋白质-变性蛋白质-蛋白胨-多肽-二肽-氨基酸

6显色反应

1双缩脲反应：蛋白质在碱性溶液中与硫酸铜作用呈现紫红色,称双缩脲反应可以做蛋白质的定量测定（太键）

2乙醛酸反应：蛋白质先加入乙醛酸,然后加入浓硫酸,使溶液分层,在分界处出现红色、绿色、或紫色环,摇匀后全部混合成紫色（乙醛酸和色氨酸的缩合物颜色）

3与水合茚三酮的反应：与氨基酸相似,蛋白质溶液中加入水合茚三酮并加热至沸显蓝色

蛋白质的盐析:蛋白质溶液中加浓无机盐溶液,使蛋白质析出

对象:高分子等(如蛋白质等)

变化条件:浓无机盐溶液

变化实质:物理变化(溶解度降低)

可逆

用途:分离,提纯

蛋白质的变性:蛋白质在某些条件作用下凝聚,丧失生理活性

对象:高分子等(如蛋白质等)

变化条件:受热、紫外线、强酸、强碱、重金属盐,某些有机物等

变化实质:化学变化

不可逆

用途:杀菌,消毒等

蛋白质的胶体凝聚：胶体中加入强电解质,不同电荷的胶体或加热而使之凝聚成大颗粒

对象:带电的胶粒

变化条件:强电解质,不同电荷的胶体,加热

变化实质:物理变化

不可逆

用途:鉴别,分离等

蛋白质的水解反应：

蛋白质+H2O ＝（酶的催化）＝ 氨基酸

蛋白凝固剂是强凝聚剂，原因如下所述：

凝固剂又称强凝聚剂或即效型凝聚剂，是使食品结构稳定、使加工食品的形态固化、降低或消除其流动性、且使组织结构不变形、增加固形物而加入的物质。主要作用是使豆浆凝固为不溶性凝胶状物的豆腐。常用的凝固剂可分为盐类和酸类。盐类凝固剂常见氯化镁、硫酸钙。酸类凝固剂常见葡萄糖酸内酯。又称强凝聚剂或即效型凝聚剂。一种能使胶乳或橡胶溶液迅速凝固的物质。种类较多，应用很广。在胶乳工业中常用的主要是酸类、盐类等电解质。因其粒子能中和胶体粒子的电荷从而凝固。包括醋酸铵和醋酸的水溶液、硝酸钙的醇溶液、氟硅酸钠的水溶液、醋酸和甲酸等。凝固剂：是使食品中胶体（果胶、蛋白质等）凝固为不溶性凝胶状态的食品添加剂，又被称为组织硬化剂。琼脂是固体和半固体培养基常用的凝固剂。汤勺，大锅，筛子，纱布，熟石膏粉，量杯，搅拌器，当然黄豆是必不可少的。纱布是在药店买的，熟石膏粉在商店有卖制作过程：超市买回的干黄豆先用冷水浸泡一个晚上，让其吸够充足的水分；打豆浆前先用量杯量一量共有多少杯黄豆；以便按比例调制石膏水；用搅拌器将水和黄豆按2:1的体积比打成豆浆，即1量杯黄豆配2量杯水。黄豆打的越细越好，这样豆浆才够浓；将打好的豆浆用双层纱布过滤，倒入大锅加热。过滤出来的豆渣先找个容器装好，稍后另有他用；注意豆浆快煮开的时候一定要守候在炉子旁边，以免煮出的豆浆泡沫喷出来，收拾起来比较麻烦；豆浆煮开后漂去沫，放在一边静置5分钟，最好不要继续放在刚关掉火的炉子上，因为瑞典的电炉降温会持续一断时