灰度值分析目的蛋白内参比值大于1可以吗

western blot结果的分析是一个主观性比较强的过程

western是一个半定量的实验。所以一般是作为定性的验证试验

首先要分析的就是有无目的蛋白的条带，有无条带就是一个定性的结果，这种分析是比较简单。当然这其中还要综合考虑内参等对照样品。

然后就是有条带之后，各个条带灰度值的分析，而对其灰度值的量化不外乎是在肉眼可见的基础上在给出一个数值的参考而已。

所以说western blot结果的分析是一个主观性比较强而且需要综合考虑的过程

首先解释一下，为什么要分析灰度值？

灰度的概念是使用黑色调表示物体，即用黑色为基准色，不同的饱和度的黑色来显示图像。采用ECL发光时，蛋白条带发出的荧光会曝光在胶片上，留下的黑色条带。然而胶片扫描后为蓝色背景、黑色条带，这并不是单纯的黑灰白颜色。因此，我们首先得在Photoshop中将整张去色，使彩色变成黑白，形成近灰色背景、黑色条带的类型。此时，条带的深浅和面积综合代表着蛋白的量。灰度值分析自然就成为我们的首选。

延伸说一下，免疫组织化学染色(IHC)结果本身为近白色背景、棕**阳性表达，这时我们就不能直接用灰度反映阳性表达强弱了，而是积分吸光度，也就是咱们常说的平均光密度(IOD)。如果你真的想用灰度计算IHC结果，显然你需要将转为灰度图再计算。此处不表。

分析图文步骤如下：

Image J软件界面 ↓

1 转换为黑白图：

首先使用Photoshop打开胶片扫描，点击“图像>调整>去色”，将彩色转化为黑白，并使用裁剪工具将目标条带裁剪至合适大小后另存。

2打开Image J软件：

21打开文件： File>Open； 将转化为8bit类型： Image>Type>8-bit。

(此步骤的目的是为了将的每个像素用8bit表示，这样的话，整个的灰度将分为256个级别，即黑、灰、白的像素模式；若保留原始的16bit格式或RGB格式，灰度级别会呈指数增长，并有其它颜色混入，造成计算误差。)

22将整张背景灰度均一化，消除背景影响：

Process>Subtract Background，默认数值为50即可。

23将黑白颜色反转。

使背景为黑色而条带为白色。既还原了条带发光时的样子，也方便我们后面圈选条带：Edit>Invert。

24设置从测量指标：

Analyze>Set Measurements，选择Area面积、平均灰度值Mean gray value、积分灰度值Integrated dendity。

(解释一下，我们最终要使用的值为积分灰度Integrated dendity，而不是平均密度值Mean gray value。因为平均灰度仅是选定区域的平均灰度数值，而积分密度值则加权了平均灰度和选定的面积，这样选择就消除了选定面积大小对灰度值的影响。希望大家能好好理解这一概念，未来我讲到IHC测量时将详细说明。)

25设置测量单位为“单个像素”：

Analyze>Set Scale，将Unit of length中的inch改为pixels。

26选定需要测量的条带，并测量积分光密度：

使用矩形选框、椭圆形选框或手动绘制选框(手残党勿用)，将面积最大的条带完全圈住，快捷键Ctrl+m测量，弹出Results结果框，结果中的IntDen即积分灰度值；继续左键点击选定框中间，不要点框线(否则选定框的大小会改变，要保证框选范围一致)，拖动选定框并移动至其它条带，快捷键Ctrl+m测量；重复操作至所有条带测完，最后不要忘了在无条带位置加测背景的灰度。

27测量结束后，点击Results框中的Edit，选择Select All，粘贴至Excel，开始下一步的分析。

28积分灰度值的计算和标准化

首先，将所有条带的IntDen都减去背景的IntDen，以扣除背景影响；然后用目标蛋白的灰度值除以其对应泳道的内参照条带灰度值，以此作为该组的目标蛋白相对表达量A。

标准化方法1：如果你是用一张膜来统计，那么直接用所有组的A值除以对照组A值，此时对照组结果为1，其它组结果为对照组的倍数，以此做均一化。

标准化方法2：如果你是用2张或以上的膜来一起统计，那么首先计算所有膜上的对照组A的平均值A’，然后用其它组的A值除以A’，以此做均一化。这种方法的前提是不同膜之间的背景颜色要相近，若偏差大则数据会很乱。

事实上，还有一种采用波峰下面积分析条带的方法。 即通过半自动描绘电泳条带的等高线边缘来得到等高线区域内部面积，再将该面积乘以区域内平均光密度值得到条带内部总的信号量。这种计算方法可在Image J或者Quantity One上实现。但是有人注意到此法的缺陷，故我没有具体说明这种测量方法。附上链接，有兴趣的同志们可以看看。

http://muchongcom/t-3077265-1-authorid-593313

HD灰度分析中的175是将灰度值范围划分为175个等级。根据查询相关公开信息显示，HD灰度分析中的175是指将灰度值范围从0~255划分为175个等级，对每个等级内的像素点进行统计分析，在图像处理中常用于图像的分割和特征提取等方面，可以提高图像处理的准确性和效率。HD灰度分析是一种用于图像分析和处理的方法，主要是针对数字图像中像素点的灰度值进行分析。

WB是研究蛋白表达的一个经典方法。对于一些时间点或者是不同组织蛋白表达量的分析就涉及到量的变化。一个比较简单的综合性质图像处理软件Image J可以很方便的进行灰度分析。

对于一些时间点或者是不同组织蛋白表达量的分析就涉及到量的变化。通过观察处理前后条带的深浅判断该处理对基因的表达造成的影响，这种判断是存在误差的，这时候就需要对结果条带的灰度值进行计算并做统计分析——目的蛋白的灰度值除以内参的灰度值，以校正误差，所得结果代表某样品的目的蛋白相对含量，这样得到的结果才更加准确、更有说服力。

image J灰度分析步骤

· 打开Image J软件，导入WB条带：File→Open→找到WB条带。

· 把转化成灰度，一般灰度分析的要求8bit就好：Image→Type→8-bit。

· 消除背景影响：Process>Subtract Background 选择50基本可以。

· 设置定量参数：Analyze>Set Measurements, 点击面积area，平均密度mean gray value，和灰度值Integrated Density

· 设置定量单位 Analyze>Set Scale,在“Unit of length” 边的方框里输入 "pixels"（像素）

· 第一个矩形工具→选上所有条带→analyze→Gels→select first lane

· 分析圈中条带analyze→Gels→plot lanes出现山峰样图。

· 选中直线工具，将开口波峰关闭。

· 选中魔棒工具，点击波峰，就得出所有area值。

· 当测定完所有条带，选结果中的“Edit”的“Select All”，然后复制数据“IntDen”到Excel表即可进行分析。也可以直接在Results对话框中，选择File → Saveas，直接导出excel表格。在excel表格中将目的蛋白的灰度值除以内参蛋白的灰度值，进行归一化处理。