什么叫“抑制PCR”，什么叫“差减杂交”

抑制 PCR 是利用链内退火优于链间退火的特点,使非目的序列片段两端反向重复序列在退火时产生类似发卡的互补结构,无法作为模板与引物配对,从而选择性抑制非目的基因片段的扩增

差减杂交技术是一种用于寻找基因组之间差异的有效的方法其通过去除被比较的两组基因组之间的共有序列,富集差异序列的方法来达到寻找差异基因的目的

　一、血细胞计数和分类计数

　采血不顺畅、抗凝剂比例不当或混匀不彻底使得抗凝不充分导致的血液凝固或血细胞聚集，导致相应细胞计数结果的偏低;聚集的细胞还可能被仪器误判为其他细胞数量的不准确。

　末梢血采集过程中过分挤压造成组织液混入，导致血小板的聚集，导致血小板计数值偏低，同时组织液的混入还可引起血液的稀释。

　抽血、混匀手法过于剧烈或添加物不当造成的溶血，可导致细胞计数结果偏低。在末梢血采集时，消毒剂未完全干燥之前进行穿刺可能导致血细胞的破坏，引起计数结果偏低。

　炎症浸润部位采血导致局部炎症细胞的混入，导致细胞形态的不正常，血细胞的黏附、聚集合并导致细胞分类计数结果受影响。

　血液细胞学检查应使用EDTA抗凝，错误的抗凝剂可能引起血细胞形态的变化，造成血细胞计数和分类的不准确，如草酸盐和肝素抗凝可引起血小板数、白细胞数和淋巴细胞计数结果的偏低。

　二、出凝血项目

　采血不顺畅、血量过少引起抗凝剂比例不当或混匀不彻底使得抗凝剂不充分，导致凝血过程激活和凝血因子的消耗。这种情况可能引起内源性、外源性凝血时间的延长以及部分凝血因子测定结果的偏低。错误的抗凝剂如EDTA、肝素，尤其是肝素会造成PT、APTT时间的延长;抽血不顺畅，压脉带绑扎时间过长(不宜超过30s)引起血流淤带或血管受损可能引起组织因子进入血液，造成部分凝血因子测定结果降低。

　三、红细胞沉降率

　标本溶血、采血不顺畅、抗凝剂比例不当或混匀不彻底等使得凝血激活，血浆成分改变，红细胞形态变化等标本采集缺陷均可能引起不同程度的红细胞聚集，从而引起血细胞沉降率的加快。此时可能引起组织因子进入血液，造成部分凝血因子测定结果降低。

　四、生物化学项目

　生物化学主要测定人体内的离子、酶类和代谢物质。这些物质在人体不同组织、细胞内浓度差异比较大，受溶血影响大;部分物质如酶类和代谢产物稳定性差，易降解，还有化学方法本身特异性较差，易受标本中异常物质的干扰，因此生物化学项目的检测对标本要求较高。

　1溶血：当溶血发生时，红细胞内容物进入血浆，引起血浆成分的改变，对一些细胞内外浓度差较大的检测项目(如谷草转氨酶、乳酸脱氢酶、钾)的测定结果造成较大的影响。

　2脂血：脂血主要是由于血清中的乳糜微粒增多引起的，因后者具有散射光的特性，对比色法和比浊法均可产生严重的干扰，而且这种干扰不能通过双波长进行消除。

　3黄疸：胆红素在400～540nm波长处有光吸收，标本放置时间过长或通过氧化剂后胆红素还可被氧化为胆绿素、胆褐素，这些物质同样可以引起光吸收的改变，从而影响检验结果，对于单波长的仪器这种影响更为显著。

　4抽血不顺畅、压脉带使用可导致静脉血血流的瘀滞，造成血乳酸浓度的升高。

　5血气分析样品在样本采集过程中若未排空气或未与空气完全隔离，则可能引起氧分压测定结果升高，二氧化碳分压测定结果降低。

　五、免疫学检测项目

　免疫学项目是通过标记或不标记的抗原抗体反应对被测物(抗原或抗体)进行测定，由于抗原抗体反应具有很好的特异性，因此测定结果受影响相对较少。然而由于免疫学检查项目被测物含量一般较低，若样本存在缺陷，尤其是交叉污染，一旦发生，对结果产生的影响可能较大。免疫学测定常用的方法包括免疫浊度法、酶标记显色的'方法，如ELISA和免疫印迹、荧光标记的方法、胶体金标记的斑点渗滤或层析方法，不同的检测方法对标本缺陷的敏感性不同。

　1免疫浊度法。使用光学方法直接对抗原抗体反应产生的沉淀进行检测，因此对标本的颜色、透明度比较敏感，严重的溶血、脂血和黄疸可能对此类实验产生干扰，造成结果偏高。

　2酶标记显色技术。通常使用辣根过氧化物酶等进行标记并催化底物显色，标本中如有强还原剂污染(如维生素C输注同侧肢体采血)时，会对结果产生影响，产生假阴性。另外由于血红蛋白具有过氧化物酶活性，严重的溶血标本也可能催化底物显色，提高本底或产生假阳性。

　六、血培养

　不合格血培养标本主要为污染、血液和培养液比例不当、不恰当的血培养瓶。

　1污染 采集不规范可以造成污染可能发生于血培养操作的任何阶段，大量研究表明，皮肤定植菌群是血培养污染的常见细菌，说明皮肤消毒的不彻底和采血操作不当是污染的主要原因。采血过程中血液易受到皮肤表面菌群的污染，主要在外周静脉穿刺时，局部皮肤消毒不彻底，细菌随针刺带入被检血液而被培养出来。其次，长期留置血管导管的患者，其导管长期暴露于皮肤外界，造成这些菌群的移生。血液培养也常从这些导管处采血，因此经常会在采血过程中将导管内移生的细菌带走而培养出来。即使严格的无菌操作采集血标本也很难将污染率控制在2%以下。血培养污染将导致不必要的抗生素治疗，延长住院时间，增加患者医疗费用和细菌耐药性的产生。

　2血液和培养瓶比例不当 成人和儿童血培养血量的采集标准不同，应严格按照厂家推荐的标准进行采集，采血量过多或少均会降低血培养的阳性率。

　3选择不恰当的血培养瓶 全自动血培养瓶的种类有普通瓶、中和抗生素瓶、厌氧瓶、儿童瓶等，每一种培养瓶满足不同的临床需求，选择不恰当的血培养瓶将降低阳性率。

　七、分子生物学检测项目

　分子生物学标本的不合格常见于抽血操作不规范引起的外源核酸污染。模板RNA降解以及PCR抑制物的存在。

　1外源核酸污染 由于PCR的灵敏度非常高，理论上一个核酸分子的污染都有可能引起结果的假阳性，因此PCR标本采集最好使用无菌、无核酶的一次性器材，取材必须严格执行无菌操作，并小心防止混入操作者或受检者的毛发、皮屑等。密封运输和保存，不能在扩增区域进行标本的采集和处理，防止PCR产物的污染。

　2靶基因的降解 一般情况下，无菌采集的DNA样本稳定性较好，在室温下放置8h仍不影响检验，但如果操作不当、抽血容器不清洁、放置时间过长或有污染，DNA链有可能发生断裂，使长片段的扩增变得困难。靶基因降解对于RNA样品影响更为严重，由于环境中大量RNA酶的存在，若样品保存、运输条件不佳或存放时间过长，模板RNA非常容易降解，造成假阴性。

　3PCR抑制物 反转录反应和PCR反应均为酶促反应，任何可能抑制这些反应的物质都会影响检验的结果。样本采集缺陷导致的常见的抑制物包括肝素、血红蛋白、乳铁蛋白、IgG、蛋白酶、纤维素等。

　八、末梢血和静脉穿刺样本分析物的差异

　尽管末梢血和静脉血分析物差异很小，但葡萄糖、钾、总蛋白和钙等项目的统计学和(或)临床存在显著性差异。末梢血的血红蛋白、葡萄糖、钾检测的结果高于静脉血，而钠、氯、钙、胆红素和总蛋白的检测结果低于静脉血。末梢血氧分压和氧饱和度低于动脉血。运用末梢血检测这些项目时应建立参考范围，同时在检验报告上注明标本类型。

　对于不合格的标本，即使实验室采用最好的方法和技术，检测工作都是无效的劳动，检测结果会贻误患者的及时诊断和正确治疗。因此，正确采集标本是临床检验分析前阶段质量保证不可或缺的重要环节，也是保证临床检验结果准确、可靠、有效的基础。

假阴性分析

有些确诊病例，核酸检测结果多次为阴性，主要原因归纳为：

病毒入侵人体初期，人体内病毒量尚未达到可检测的程度。采样时机和采样部位的不同，可能导致所采集的标本中没有足够量的病毒;

任何检测试剂都有其检测下限，如果患者标本内的病毒达不到所使用试剂的检测下限，则会出现假阴性;

实验室仪器设备性能和人员检测能力差、质量管理落实不到位等也会产生“假阴性”;

采样不规范、采集部位不当、采集标本不典型，导致标本中被病毒感染的细胞太少或没有。即可能造成“假阴性”。可见规范采集的重要性。

靶基因的降解：

一般情况下，DNA样本稳定性较好，在室温下放置8h仍不影响检验，新型冠状病毒为RNA病毒，靶基因降解对于RNA样品影响更为严重，由于环境中大量RNA酶的存在，若样品保存、运输条件不佳或存放时间过长，模板RNA非常容易降解，造成假阴性。

PCR抑制物：

反转录反应和PCR反应均为酶促反应，任何可能抑制这些反应的物质都会影响检验的结果。

假阳性因素分析

1、外源核酸污染：由于PCR的灵敏度非常高，理论上一个核酸分子的污染都有可能引起结果的假阳性，因此PCR标本采集最好使用无菌、无核酶的一次性器材，取材必须严格执行无菌操作，并小心防止混入操作者或受检者的毛发、皮屑等。密封运输和保存，不能在扩增区域进行标本的采集和处理，防止PCR产物的污染。

只要有少的扩增产物将标本或反应管污染即可出现假阳性,PCR仪器的性能差异和温控不准等质量问题造成非特异性扩增也会导致假阳性现象。

如果样本采集和PCR试剂配制及反应实验过程中,引物设计不合理,选择的扩增列序与非目的性扩增列序具有同源性,检测样品出现交叉污染、PCR试剂污染或PCR扩增产物污染、气溶胶污染以及实验室中克隆质粒污染都会造成假阳性现象出现。

PCR检测体系含有阳性内对照，该内对照使用的是内源性对照，通过检测内标是否正常来监测待测样本采样、提取过程以及样本中是否有核酸抑制物，避免PCR假阴性。

不合格样本影响检验结果

当采样时若标本没有采集到位或采集量极少，在进行分子检测中就没有内标，无法报告定性结果。

在新冠病毒核酸检测中，不合格样本通常是由于采样问题和采样用具问题导致的。

在临床中另一个比较常见的情况就是送检样本盖子没盖严或有泄漏。这种情况下既会存在生物安全风险，同时发生泄漏后标本可能会受到污染或含量变少不够检测，在这种情况下也会报告不合格样本。

由于粪便中含有大量Taq 聚合酶的抑制物质, 很多方法提取的DNA 其扩增效果不佳, 如H08ss 在PCR 反应中就加了牛血清蛋白来克服抑制剂对Taq 聚合酶的抑制作用。目前采取的方法有多种, 作者将其大致分两类:

( 1 ) 粪便裂解后纯化DNA , 如Ernest et al (2000) 在粪便经蛋白酶K处理后, 用酚- 氯仿多次抽提, 然后, DNA 溶液经聚丙烯酰胺葡聚糖柱子洗脱来纯化DNA ; Taberlet et al (1996) 、Reedet al (1997) 和Parsons et al (1999) 用硫氰酸胍处理粪便, 直接用硅粒沉淀DNA 而使之与杂质分离达到纯化的目的; Constable et al (1995) 和Savill et al (2001) 在用蛋白酶K 裂解粪便的同时另外加入了十六烷基三甲基溴化铵( Cetylt rimethyl2ammoniumbromide , CTAB) 消化PCR 反应抑制物, 再经多次酚- 氯仿抽提纯化DNA ; Ding et al (1998) 将DNA 抽提试剂盒

(XTRAXTM DNA Ext raction Kit , BIODESIGN International) 应用于大熊猫的粪便DNA 提取, Tengel et al (2001) 介绍了提取粪便DNA 的试剂盒QIAamp DNA Stool Mini Kit , Germany) 清除PCR 抑制物; Reed et al (1997) 将碱性多价金属离子螯合树脂Chelex2100 应用于清除抑制物(Reed 在自己的文章中已证明该方法并非理想) 。这些方法或操作繁琐, 花费高, 或结果不十分理想, 或缺乏实验室通用性。

(2) 粪便预处理, 如Deuter et al (1995) 先将粪便于- 80 ℃冷冻, 再匀浆, 经两次差速离心除去了残渣, 但经过柱洗脱才得到了纯度高的DNA ; Lantz et al (1997) 利用聚乙二醇和葡聚糖40 组成的二相系统对粪便进行预处理, 很理想地除去了PCR 抑制物, 但花费较高, 缺乏通用性; Machiels et al (2000) 用磷酸缓冲盐溶液和酚- 氯仿- 异戊醇组成的二相系统对粪便预处理, 但其后的处理过程十分繁琐。

介绍一种在细胞裂解前经丙酮预处理的抽提方法。丙酮是一种优良的有机溶剂, 在DNA 的提取过程中曾被用来消除抑制物, 有很好的效果(Schneiderbauer et al , 1991 ; Udy et al , 1994 ;施苏华等, 1996 ; Purohit et al , 2003) 。本实验

预处理中丙酮能很好地将粪便中的色素、多糖及一些有机盐等PCR 抑制物除去, 最后得到的DNA 可用于PCR 扩增, 并用于进一步的遗传分析。

一种从大熊猫粪便中提取DNA 的改进方法钟　华①　赖旭龙②　魏荣平③　刘中来①33

( ①华中师范大学生命科学学院, 武汉430079)

( ②中国地质大学地球科学学院, 武汉430074) ( ③中国保护大熊猫研究中心, 四川卧龙623006)

。在粪便DNA的提取过程中采用一个新的预处理方法, 将粪便用预冷的丙酮洗2～3 次, 除去粪便中含有的大量PCR 抑制物,然后用蛋白酶K裂解、酚- 氯仿抽提, 能提取到纯度很高的DNA 供PCR 扩增。

粪便DNA小量提取试剂盒

动物粪便样品中存在大量有意义的基因组DNA，其DNA主要来自于动物自身脱落的消化道细胞、消化道中各种细菌(如大肠杆菌)或真菌等微生物,以及一些末消化食物DNA。由于粪便中存在大量抑制因子，所以常规的DNA纯化方式并不能有效地去除这些杂质，而导致下游实验的失败，如PCR不能扩增出所需片段。Omega Biotek

公司采用了硅胶柱纯化方式和独特的溶液系统,能有效去除动物粪便中各种影响下游实验（如PCR）的抑制因子，并能高效地回收粪便中的基因组DNA。

动物粪便样品经PBS和ST1重悬后，70°C处理5分钟裂解细菌；离心去除不溶解的杂质，加入ST2和蛋白酶消化样品；氯仿抽提去除蛋白质，转移上清液加入异丙醇沉淀DNA，进一步去除各种杂质；加入灭菌水溶解DNA，调节结合条件，上柱离心吸附DNA；经过两次快速洗涤，去除残留的杂质和抑制物，最后DNA溶解于灭菌水或低盐缓冲液中。纯化的DNA可直接用于PCR,Southern杂交，定量PCR等各种灵敏实验。