无菌检验方法验证

　无菌检查 方法 是为了检查药典要求无菌的制剂及其他制品是否无菌而建立的试验方法！至于无菌检查具体有哪些验证方法呢？下面就随我一起来了解下吧！

无菌检验方法验证

　无菌检查方法验证一般分为前验证和再验证两种。

　前验证，也称预验证，指在无菌分析方法正式使用前，按照预定验证方案进行的验证。如果没有充分的理由，任何检查方法必须进行前验证。

　再验证，指某一检查方法经过验证并在使用一段时间后进行的，旨在证实已验证状态没有发生飘移而进行的重新验证及对检查方法进行修订、改变时进行的验证。

　通常一个无菌产品的检查流程为：首先基于产品的剂型、溶解度等性质，按照药典的要求确定是否需要进行前处理;然后根据产品的特性是否有抑菌性，确定是否需要增加去除产品抑菌性的方法;最后验证整个检查方法中用到的一切及试验过程中的每一个环节包括样品的预处理方式、检查过程、培养条件等均不影响样品中微生物的生长。

　前处理方法直接影响后续步骤的效果和重现性，应是验证的重点。

　供试品中抑菌活性的去除是当前验证工作的重点，尤其强调应充分验证供试品本身对微生物生长的影响。

　(一)具体的验证方法如下：

　1 菌种的选择

　无菌检查方法验证中通常选择以下6种试验中常用的控制菌的标准菌株，它们分别代表不同类型的菌种：枯草芽孢杆菌 [CMCC(B)63 501]代表药品中常见的污染菌——芽孢杆菌、金**葡萄球菌 [CMCC(B)26 003]代表革兰阳性菌、生孢梭菌 [CMCC(B)64 941]代表厌氧菌、大肠埃希菌 [CMCC(B)44 102]代表革兰阴性菌、白色念珠菌 [CMCC(F)98 001]代表酵母菌、黑曲霉菌 [CMCC(F)98 003]代表霉菌。

　2 菌液的制备

　接种金**葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中或营养琼脂培养基上，接种生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中，30~35 ℃培养18~24h;接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中或改良马丁琼脂培养基上，23~28℃培养24~48h，上述培养物用09%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数小于100cfu的菌悬液。接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基上，23~28 ℃培养5~7天，加入3~5ml含005%(ml/ml)聚山梨酯80的09%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。然后，采用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管内，用含005%(ml/ml)聚山梨酯80的09%无菌氯化钠溶液制成每1ml含孢子数小于100cfu的孢子悬液。

　3 样品的前处理

　无菌产品中每个成分应该是均匀的，因此只要确定在验证的方法中，按所需的总接种量即可，而不必像样品日常检测中按规定的容器数取样。

　如果制备样品时需要使用溶解剂、稀释剂、助溶剂、破乳剂等溶剂，需要确保这些溶剂是有效的，并且其使用对微生物生长无影响;或者制备过程中需要对样品进行加热助溶、离心等操作时，需要确保加热的温度、离心速度和离心时间等对微生物生长或分布无影响。 不需前处理的样品免做。

　(二)消除样品抑菌性的方法

　无抑菌性样品的验证方法：依据产品溶解性和微生物限度选择合适的中性稀释剂溶解和稀释，用直接接种法验证，常用中性稀释液或淋洗液。

　对于具有抑菌性样品的验证方法，首先确定样品的抑菌作用(抑细菌、真菌试验验证)，选择敏感标准菌株对供试品抑菌活性去除效果检查(阳性菌回收试验)。 常用的消除样品抑菌活性的方法如下：

　1 稀释法：利用降低供试品的相对浓度，将样品稀释至最低抑菌浓度下进行。如：取规定量的样品溶液至较大量的培养基中，使单位体积内的样品含量减少，至不含抑菌作用。

　2 薄膜过滤法：利用体积差异分离，通过薄膜过滤，微生物被截于滤膜，培养薄膜观察有无微生物生长。通常薄膜孔径应不大于045μm，直径一般为50mm，若采用其他直径的滤膜，冲洗量应进行相应的调整。滤器和滤膜在使用前采用适宜的方法进行灭菌。使用时应保证滤膜在过滤前后的完整性。水溶性供试液过滤前先将少量的冲洗液过滤以润湿滤膜。油类供试液其滤膜和滤器在使用前应充分干燥。 供试液经过滤膜过滤后，若需要用冲洗液冲洗滤膜，每张滤膜每次冲洗量为100ml。总冲洗量不得超过1000ml。

　3 化学中和法：利用化学(生物)专属性灭活，常用中和剂或灭活方法有：对氨基苯甲酸、卵磷脂、聚山梨酯-80等。对化学中和剂不敏感的样品，用酶中和，如β -内酰胺酶。

　4 联合使用：将以上两种或几种方法组合运用，以消除样品的抑菌性。适用于抑菌作用较强的中西药制剂。

　5 其次按照以下要求制备3组样品：

　样品组：选择以上适当的方法中和样品，加入少量验证微生物(接种量少于100cfu)。

　对照组：01%蛋白胨或pH70无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液,加少量微生物(接种量少于100cfu)。

　阳性对照组：将试验菌株直接接种于培养基中(接种量少于100cfu)。

　6 最后结果分析如下：

　样品组与对照组微生物生长数量相似，表明中和剂的中和方式有效消除了样品的抑菌性(即有效性)，如果对照组与阳性对照组的微生物数量相似，表明样品预处理、消除样品抑菌性的方法、检测程序和培养条件等均不影响微生物生长(即无毒性)。样品如无抑菌性，省去对照组试验，样品组与阳性对照组直接比较。样品组微生物生长数量不及阳性对照组微生物生长数量，表明样品的预处理、试验用器具材料、培养条件等方面存在对微生物生长不利的因素。

　(三) 为考查验证方法的稳定性和重现性，验证至少需3个不同批次的同类样品，分别进行3次验证试验。

　无菌检查方法验证试验设计

　薄膜过滤法：按照药典的要求取每种培养基规定接种的样品总量按薄膜过滤法过滤、冲洗，在最后一次的冲洗液中加入小于100cfu的试验菌，过滤。取出滤膜接种至硫乙醇酸盐流体培养或改良马丁培养基中，或将培养基加至滤桶内。另取一装有同体积培养基的容器，加入等量试验菌，作为对照。按照药典的要求的温度和时间进行培养。

　直接接种法：取符合直接接种法培养基用量要求的硫乙醇酸盐流体培养基8管，分别接入小于100cfu的金**葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌各2管;取符合直接接种法培养基用量要求的改良马丁培养基4管，分别接入小于100cfu的白色念珠菌、黑曲霉各2管。其中1管接入每支培养基规定的供试品接种量，另1管作为对照，按照药典的要求的温度和时间进行培养。

　结果判断

　同对照管比较，如含供试品各容器中的试验菌均生长良好，则说明验证通过;如含供试品的任一容器中的试验菌生长微弱、缓慢或不生长，验证失败，应采用增加冲洗量、增加培养基的用量、使用中和剂和灭活剂、更换滤膜等方法，消除供试品的抑菌作用，重新进行验证。

无菌检查的常见方法

　首先要检查方法验证方案设计的科学性和完整性，是否有与药典方法相悖的地方，尤其是产品本身的抑菌性，检查方法的选择，是直接接种法还是薄膜过滤法等。

　无菌检查方法验证的硬件是否具备及是否已经进行了相关的确认。如使用黑曲霉菌是否具有生物安全柜并进行确认，无菌室的确认及日常监测，培养箱的型号及数量和进行确认的情况等，智能集菌器、全封闭无菌试验过滤培养器的型号、性能，滤膜是否符合规定等。

　验证中各个环节有关数据的真实性，如产品本身抑菌性试验数据，菌种回收率和培养基适用性和灵敏度检查数据，菌种的传代、销毁和使用记录，无菌检查操作记录、培养记录等。

　无菌检查中偏差的处理是否真的找到了根本原因，是否在没有确切的原因前就对样品重新检查并依据新的检查结果放行产品。

　验证的方法与无菌检查操作规程和无菌检查记录是否完全一致，如操作步骤、检查方法、检查环境、试验耗材均需与实际检查操作规程及验证过程完全相符。

　为了考查验证方法的稳定性和重现性，验证时是否至少采用了3个不同批次的同类样品，分别进行了3次验证试验。

　使用新的滤膜或过滤器(不同厂家或批号、型号)是否重新进行样品试验组、蛋白胨对照组和阳性对照组的验证确认。

　除非样品不能采用过滤的方法(难溶解)，企业是否采用全封闭的薄膜过滤法。

　菌液的保存条件和保存期限是否符合药典的要求，对于黑曲霉孢子悬液是否有验证的资料。

　无菌检查的注意事项

　培养基的适用性检查包括培养基的无菌性检查和培养基的灵敏度检查。

　中国药典附录中规定的检验数量不包括阳性对照用样品量，虽然附录另处有专门说明，仍然容易忽略。

　无菌检查时应强调“检验数量”，主要是保证试验结果的代表性，而阳性对照试验和验证时仅须满足“检验量”总量要求即可，以保证试验结果的可靠性，验证试验可以由此减少大量的样品;工作菌株的传代次数不得超过5代，以防止过度的传代增加菌种变异的风险。这里“代”的定义是指，活的培养物接种到微生物生长的新鲜培养基中培养，任何亚培养的形式均被认为是转种或传代一次。

　菌液加入，按规定应在最后一次冲洗液中加入阳性菌液，主要是考虑过滤器的有效性。过滤器的有效性应由提供企业控制，用户可采用适当方法抽查(如检查阳性菌液通过滤筒的流出液)。

　实验室菌种的处理和保存的程序应标准化，以尽可能减少菌种污染和变异。

　试验时菌悬液并不是只要活的菌体就行，而是要保持旺盛的生命力，所以菌悬液存放时间不能太长。

　菌液制备后若在室温下放置，应在2h内使用，若保存在2～8℃，可在24h内使用。黑曲霉孢子悬液可保存在2～8℃，在验证过的贮存期内使用。

　薄膜过滤法采用大样品量集菌的方法，具有代表性，不易漏检，仪器操作相对简单。该系统是全封闭过滤系统，避免了操作过程中外源性微生物的污染，对试验结果的可信性影响较小。因此无菌试验采用薄膜过滤法还是直接接种法并不依赖于验证结果，而是取决于样品的特性，如能采用过滤的方法均应采用薄膜过滤法检查。

　若样品含有抑菌成分，当采用薄膜过滤法时，应先将供试液稀释后在过滤，这样可以减少滤膜对样品的吸附，减少冲洗量，进而减少微生物的损失或伤害。

　无菌检查应作为稳定性考察的项目进行，以便对产品有效期的制定和合理的确定储存条件提供重要的依据。

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4 无形资产的评估方法

1、唯一性约束：通过为表中的某些字段设置唯一索引，使得这些字段中的值不能重复，从而保证数据库中数据的唯一性。

2、外键约束：通过在多个表之间建立外键关联，使得表中的数据能够有效地进行交互，从而保证数据库中数据的完整

3、检查约束：通过在表中设置检查约束，来检查某一列的值是否满足一定的条件，从而保证数据库中数据的完整性。

4、默认值约束：通过为表中的某些字段设置默认值，如果用户没有为该字段输入值，就会自动使用默认值，从而保证数据库中数据的完整性。

5、触发器：通过设置触发器，在数据发生改变时自动进行检查，从而保证数据库中数据的完整性。

6、程序级的完整性校验：在应用程序中添加相应的完整性校验代码，从而保证数据库中数据的完整性。

--- 61、空值校验：检查表中某个字段是否有空值，如果存在空值则返回错误信息。

--- 62、长度校验：检查表中某个字段的长度是否符合要求，如果不符合要求则返回错误信息。

--- 63、类型校验：检查表中某个字段的类型是否符合要求，如果不符合要求则返回错误信息。

--- 64、值范围校验：检查表中某个字段的值是否在指定的范围内，如果不在指定范围内则返回错误信息。

　　1、利用基因重组的技术进行基因敲除，根据目的基因序列设计合成出同源基因片段，利用基因打靶技术将携带同源基因片段的基因打靶载体，用电穿孔的技术导入同源的胚胎干细胞中，利用同源基因片段取代靶基因，达到基因敲除的目的。

　2、筛选出基因打靶成功的细胞，用选择性培养基筛选出基因打靶成功的细胞。

　3、将打靶成功的细胞导入小鼠体内，观察表形。将打靶成功的细胞导入小鼠囊胚中，再将囊胚导入假孕小鼠体内，发育成为基因敲除的小鼠，观察目的基因改变后的小鼠的生物学性状改变，达到验证目的基因功能的目的。

方法学验证的内容包括准确度、精密度（包括重复性、中间精密度和重现性）、专属性、检测限、定量限、线性、范围和耐用性。

方法学(methodology)，名词。a一门学科，一次调研中所采用的实践(practice)，规程(procesure)和规则(rule)的主要部分；一组工作方法：如遗传研究方法学；故障方法学；b对于工作方法的研究或理论分析；关于知识构成的一般原则中的一个分支；用法问题方法学可以指适用于一个研究领域的理论分析，或者特定于一个知识分支的主要方法和基本原则。然而近年来，在科学和技术术语中，方法学一词已经被方法(method)这个词所取代。例如，某石油公司目前还未决定采取任何方法学以使被污染的海滩复原；但是，方法学这个词的错误使用会遮掩科学调研的工具（或许更恰当的说法应该是科学调研的方法）与科学调研的原则这两个概念之间的差别，科学调研的原则决定了如何配置和解释科学调研的工具。

验证方法：由材料员配合甲方人员对光缆开箱验货，首先检查缆盘包装是否损坏，开盘检查光缆外皮有无损伤，光缆端头封装是否良好，缆盘外侧对本盘光缆的标注是否清晰。检查完毕后，将光缆堆放整齐。

审定方法：打开光缆盘，开剥好光缆，对缆内逐条纤芯进行测试。主要检查光缆内填充物是否饱满，光缆外端端别是否符合规定，用OTDR测试每条光纤的衰减常数，光纤长度，同时对照光缆出厂记录，检查相关数据有无重大出入，并做好测试记录，发现问题及时汇报。

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