为什么微生物基因的点突变并不会导致功能完全失活

怎么用定点突变试剂盒获得显性失活突变体不同于定点突变的是基于PCR的随机突变，通过改变PCR条件提高PCR过程中的随机出错，这种方法适用于未知的蛋白质，作全局性分析，所以有人称为饱和突变（saturation mutagenesis）。不过这种方法由于没有目的性，分析操作相当繁琐，并且不会出现一个位点2个以上碱基突变，因而应用上有局限性。定点突变适用于蛋白结构已有初步了解的基因，比PCR随机突变更有目的性，也更为精确，简单，同时改造基因更加“随心所欲”。由于定点突变技术在蛋白质组学中有这非常广泛的应用前景，相信这个技术在不远的将来还会有更大的改进和发展，也必将为更多人熟悉应用。

pcr扩增时在突变位点会出现碱基减少

检测基因多态性的方法有很多,包括你所说的PCR方法以下是介绍

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1．限制性片段长度多态性（Restriction Fragment Length Polymorphism,RFLP）：由DNA 的多态性,致使DNA 分子的限制酶切位点及数目发生改变,用限制酶切割基因组时,所产生的片段数目和每个片段的长度就不同,即所谓的限制性片段长度多态性,导致限制片段长度发生改变的酶切位点,又称为多态性位点最早是用Southern Blot/RFLP方法检测,后来采用聚合酶链反应（PCR）与限制酶酶切相结合的方法现在多采用PCR-RFLP法进行研究基因的限制性片段长度多态性

2．单链构象多态性（SSCP）：是一种基于单链DNA构象差别的点突变检测方法相同长度的单链DNA如果顺序不同,甚至单个碱基不同,就会形成不同的构象在电泳时泳动的速度不同将PCR产物经变性后,进行单链DNA凝胶电泳时,靶DNA中若发生单个碱基替换等改变时,就会出现泳动变位（mobility shift）,多用于鉴定是否存在突变及诊断未知突变

3．PCR-ASO探针法（PCR-allele specific oligonucleotide, ASO）：即等位基因特异性寡核苷酸探针法在PCR扩增DNA片段后,直接与相应的寡核苷酸探杂交,即可明确诊断是否有突变及突变是纯合子还是杂合子其原理是：用PCR扩增后,产物进行斑点杂交或狭缝杂交,针对每种突变分别合成一对寡核苷酸片段作为探针,其中一个具有正常序列,另一个则具有突变碱基突变碱基及对应的正常碱 基匀位于寡核苷酸片段的中央,严格控制杂交及洗脱条件,使只有与探针序列完全互补的等位基因片段才显示杂交信号,而与探针中央碱基不同的等位基因片段不显示杂交信号,如果正常和突变探针都可杂交,说明突变基因是杂合子,如只有突变探针可以杂交,说明突变基因为纯合子,若不能与含有突变序列的寡核苷探针杂交,但能与相应的正常的寡核苷探针杂交,则表示受检者不存在这种突变基因若与已知的突变基因的寡核苷探针匀不能杂交,提示可能为一种新的突变类型

4 PCR-SSO法：SSO技术即是顺序特异寡核苷酸法（Sequence Specific Oligonucleotide, SSO）原理是PCR基因片段扩增后利用序列特异性寡核苷酸探针,通过杂交的方法进行扩增片段的分析鉴定探针与PCR产物在一定条件下杂交具有高度的特异性,严格遵循碱基互补的原则探针可用放射性同位素标记,通过放射自显影的方法检测,也可以用非放射性标记如地高辛、生物素、过氧化物酶等进行相应的标记物检测

5 PCR-SSP法：序列特异性引物分析即根据各等位基因的核苷酸序列,设计出一套针对每一等位基因特异性的（allele-specific）、或组特异性 (group-specific)的引物,此即为序列特异性引物（SSP）SSP只能与某一等位基因特异性片段的碱基序列互补性结合,通过PCR特异性地扩增该基因片段,从而达到分析基因多态性的目的

6 PCR-荧光法：用荧光标记PCR引物的5’端,荧光染料FAM和JOE呈绿色荧光,TAMRA呈红色荧光,COUM 呈兰色荧光,不同荧光标记的多种引物同时参加反应,PCR扩增待检测的DNA,合成的产物分别带有引物5’端的染料,很容易发现目的基因存在与否

7 PCR-DNA测序：是诊断未知突变基因最直接的方法,由于PCR技术的应用,使得DNA 测序技术从过去的分子克隆后测序进入PCR直接测序PCR产物在自动测序仪上电泳后测序常用方法有：Sanger双脱氧末端终止法;Maxam-Gilbert化学裂解法；DNA测序的自动化目前DNA顺序全自动激光测定法是最先进的方法

8 PCR指纹图法（PCR-fingerprints）：实用于快速的同种异型DR/Dw配型在DR/DW纯合子及杂合子个体中,每种DR单倍型及每种单倍型组合所产生的单链环状结构的大小、数目和位置各异,由于同质双链和异质双链之间的分子构象不同因此,在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳时,它们的迁移率各不相同,从而获得单倍型特异的电泳带格局即PCR指纹也有人用人工合成的短寡核苷酸片段作为探针,同经过酶切的人体DNA作Southern blot,可以得出长度不等的杂交带,杂交带的数目和分子量的大小具有个体特异性,除非同卵双生,几乎没有两个人是完全相同的,就象人的 指纹一样,人们把这种杂交带图形称为基因指纹(gene finger-printing)

9 基因芯片法：又称为DNA 微探针阵列（Micro array）它是集成了大量的密集排列的大量已知的序列探针,通过与被标记的若干靶核酸序列互补匹配,与芯片特定位点上的探针杂交,利用基因芯片杂交图象,确定杂交探针的位置,便可根据碱基互补匹配的原理确定靶基因的序列这一技术已用于基因多态性的检测对多态性和突变检测型基因芯片采用多色荧光探针杂交技术可以大大提高芯片的准确性、定量及检测范围应用高密度基因芯片检测单碱基多态性,为分析SNPs提供了便捷的方法

10 AFLP（Amplication Fragment Length Polymorphism）法

AFLP技术是一项新的分子标记技术,是基于PCR技术扩增基因组DNA限制性片段,基因组DNA先用限制性内切酶切割,然后将双链接头连接到DNA片段的末端,接头序列和相邻的限制性位点序列,作为引物结合位点限制性片段用二种酶切割产生,一种是罕见切割酶,一种是常用切割酶它结合了RFLP和PCR技术特点,具有RFLP技术的可靠性和PCR技术的高效性由于AFLP扩增可使某一品种出现特定的DNA谱带,而在另一品种中可能无此谱带产生,因此,这种通过引物诱导及DNA扩增后得到的DNA多态性可做为一种分子标记AFLP可在一次单个反应中检测到大量的片段以说AFLP技术是一种新的而且有很大功能的DNA指纹技术

11 DGGE（denaturing gradinent electrophoresis,DGGE）法

变性梯度凝胶电泳法 DGGE法分析PCR产物,如果突变发生在最先解链的DNA区域,检出率可达100％,检测片段可达1kb,最适围为100bp-500bp基本原理基于当双链DNA在变性梯度凝胶中进行到与DNA变性湿度一致的凝胶位置时,DNA发生部分解链,电泳适移率下降,当解链的DNA链中有一个碱基改变时,会在不同的时间发生解链,因影响电泳速度变化的程度而被分离由于本法是利用温度和梯度凝胶迁移率来检测,需要一套专用的电泳装置,合成的PCR引物最好在5`末端加一段40bp-50bp的GC夹,以利于检测发生于高熔点区的突变在DGGE的基础上,又发展了用湿度梯度代替化学变性剂的TGGE法（温度梯度凝胶电泳temperature gradient gelelectrophoresis,TGGE）DGGE和TGGE均有商品化的电泳装置,该法一经建立,操作也较简便,适合于大样本的检测筛选

12 RAPD（Random amplified polymorphic DNA）法

运用随机引物扩增寻找多态性DNA片段可作为分子标记这种方法即为RAPD( Random amplified polymorphic DNA,随机扩增的多态性DNA)尽管RAPD技术诞生的时间很短, 但由于其独特的检测DNA多态性的方式以及快速、简便的特点,使这个技术已渗透于基因组研究的各个方面该RAPD技术建立于PCR技术基础上,它是利用一系列(通常数百个)不同的随机排列碱基顺序的寡聚核苷酸单链(通常为10聚体)为引物,对所研究基因组DNA进行PCR扩增聚丙烯酰胺或琼脂糖电泳分离,经EB染色或放射性自显影来检测扩增产物DNA片段的多态性,这些扩增产物DNA片段的多态性反映了基因组相应区域的DNA多态性RAPD所用的一系列引物DNA序列各不相同,但对于任一特异的引物,它同基因组DNA序列有其特异的结合位点这些特异的结合位点在基因组某些区域内的分布如符合PCR扩增反应的条件,即引物在模板的两条链上有互补位置,且引物3'端相距在一定的长度范围之内,就可扩增出DNA片段因此如果基因组在这些区域发生DNA片段插入、缺失或碱基突变就可能导致这些特定结合位点分布发生相应的变化,而使PCR产物增加、缺少或发生分子量的改变通过对PCR产物检测即可检出基因组DNA的多态性分析时可用的引物数很大,虽然对每一个引物而言其检测基因组DNA多态性的区域是有限的,但是利用一系列引物则可以使检测区域几乎覆盖整个基因组因此RAPD可以对整个基因组DNA进行多态性检测另外,RAPD片段克隆后可作为RFLP的分子标记进行作图分析

基因组DNA分子发生的突然的、可遗传的变异现象（gene mutation）。从分子水平上看，基因突变是指基因在结构上发生碱基对组成或排列顺序的改变。基因虽然十分稳定，能在细胞分裂时精确地复制自己，但这种稳定性是相对的。在一定的条件下基因也可以从原来的存在形式突然改变成另一种新的存在形式，就是在一个位点上，突然出现了一个新基因，代替了原有基因，这个基因叫做突变基因。于是后代的表现中也就突然地出现祖先从未有的新性状。

1个基因内部可以遗传的结构的改变。又称为点突变，通常可引起一定的表型变化。广义的突变包括染色体畸变。狭义的突变专指点突变。实际上畸变和点突变的界限并不明确，特别是微细的畸变更是如此。野生型基因通过突变成为突变型基因。突变型一词既指突变基因，也指具有这一突变基因的个体。

基因突变可以发生在发育的任何时期，通常发生在DNA复制时期，即细胞分裂间期，包括有丝分裂间期和减数分裂间期；同时基因突变和脱氧核糖核酸的复制、DNA损伤修复、癌变和衰老都有关系，基因突变也是生物进化的重要因素之一，所以研究基因突变除了本身的理论意义以外还有广泛的生物学意义。基因突变为遗传学研究提供突变型，为育种工作提供素材，所以它还有科学研究和生产上的实际意义。

235delC是最常见的致病性突变，纯合突变导致常染色体隐性遗传性耳聋，患者多为双耳重深度耳聋（双耳大于90dB），不仅纯合突变可以致聋，235delC和其他致病突变位于两条不同的染色体上形成双重杂合性突变时，也可以导致耳聋。235delC导致移码突变，使翻译提前终止于81号密码子，比野生型的Cx26截短了145个氨基酸，产生无功能的Cx26，致缝隙连接缺损，使细胞间信息传递受阻或紊乱，从而引起听力损失[7]。

235delC与299-300delAT形成双重杂合突变。父母仅为235deC的杂合子或者299-300delAT杂合子时，听力正常，为该突变的携带者，当其后代两个致病突变同时存在且位于不同的两条染色体上，导致耳聋的发生。