方法繁多,总结如下:
1手术祛疤,较快,术后配合仙卡疤痕贴使用,效果较好
2药物祛疤,这类的产品最多,但疗效参差不齐,部分有副作用
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至今为止,对于蜂毒素的杀菌及溶血机理仍然很不确定,以往研究认为,抗细菌素类是通过穿孔模型形成膜空洞机制引起杀菌的。但深入研究发现,有些抗细菌素与细胞膜的作用方式与穿孔模型有明显不同,后来便提出了一种新的作用模式--地毯模式。
目前,抗细菌素侵膜机理占主导地位的观点仍然是穿孔模型和地毯模式机理。根据蜂毒素的这种侵膜机制,赵亚华等通过实验有目的地改造了蜂毒素的氨基酸的一级结构序列以及所要表达的蜂毒素基因。尽量使蜂毒素在与细菌细脑膜相互作用时,主要采取地毯模式侵膜而引起杀菌,同时,由于带电荷数与分子构象的改变,大大降低了它与血细胞膜两亲性作用的几率,从而达到抑制溶血性的目的。改造后的蜂毒素的溶血性与标准样品的溶血活性相比,有较大幅度降低,大约降低了143倍。
蜂毒肽发挥其众多功能的主要机理是因为蜂毒肽可以使细脑膜的透性增加,细胞内容物泄露,细胞裂解所以蜂毒肽与天然或是模型膜的作用成为蜂毒肽研究的热点。Benachir等利用钙黄绿素作为荧光标记物,系统研究了蜂毒肽诱导的膜渗漏。他们认为蜂毒肽与囊泡的结合会非常迅速,因为在蜂毒肽作用几分钟之后,内容物的流出达到最大值,并且停止;而且蜂毒肽诱导的磷脂双分子层的裂解的发生机制是“全或无”,也就是说蜂毒肽作用下,有的囊泡的内容物全部释放,而有的则保持完整,没有渗漏,这与Schwarz 等观察的一致。内容物释放的比例与蜂毒肽/脂质的摩尔比率有关,只有达到一定量的蜂毒肽才可能有内容物渗出。更为特别的是蜂毒肽可以区别出完整的和已经有物质渗出的囊泡,说明这两类脂质双分子层的性质有很大的不同。最近有很多报道认为,微粒表面的负电荷可以抑制蜂毒肽对细胞的裂解作用,Benachir等的工作表明卵磷脂双分子层表面负电荷的存在对蜂毒肽的裂解能力有抑制作用,并且与负电荷的密度成一定比例。这可能是由于静电作用吸附蜂毒肽,而不能更加深入破坏囊泡而形成渗漏。
蜂毒肽可以作用多种酶及细胞蛋白,在裂解的细胞中蜂毒肽能结合或改变几种蛋白质功能。如蜂毒肽可以抑制蛋白激酶C;与钙调蛋白(calmodulin)具有高度亲极性。Fukushi-ma实验中观察到蜂毒肽抑制小鼠大脑皮质的突触膜上依赖鸟苷酸的腺苷酸环化酶活性;还发现蜂毒肽能明显刺激Gil和Gll活性,但却抑制Gs活性。动力学研究表明蜂毒肽抑制Gs活性是因为抑制GDP的释放,从而增加了鸟苷酸造成的。而激活Gi与抑制Gs很可能与抑制腺苷酸环化酶的活性有关。细胞脂酶的活性产物包括三磷酸肌醇(IP3)、甘油二酯(DG)和脂肪酸(FA)等是细胞生理活动重要的第二信使系统,而有实验表明蜂毒肽可以激活细胞脂酶,包括磷脂酶C(PLC)、磷脂酶D(PLD)、磷脂酶Az(PLAJ及甘油三酯酶等。磷脂和甘油三酯是细胞内主要的酰化酯(包含脂肪酸)。而甘油三酯的相对含量可占细胞总脂量的5%~60%。
摘 要:采用HyperChem70结构分析软件,对蜂毒溶血肽类似物的分子体积等结构参数进行了计算分析,分别利用多元线性回归、BP-神经网络计算法进行统计分析,获得两个相关性好的QSAR(quantitative structure-function relationship)模型,结果显示,蜂毒肽溶血活性与生成热、键合能、表面积、分子体积、极化能、醇水分配系数、水合能相关,为降低溶血作用,指出在设计蜂毒肽结构时应尽量避免螺旋状结构,少用疏水性氨基酸。
关键词:蜂毒溶血肽;构效关系;线性回归;BP-神经网络
中图分类号:Q786
文献标识码:A
文章编号:1007-7847(2007)02-0038-06
蜂毒溶血肽又称蜂毒素(melittin),是欧洲蜜蜂(Apis mellifera)蜂毒的主要成分之一,它对20多种革兰氏阴性和阳性细菌有极强的抑杀作用,相对于医药上使用的传统抗生素来说,由于其特殊的作用机理而不易使细菌产生耐药性,然而,生物体存在的天然多肽其结构与功能之间的关系并非最适合,一般认为,蜂毒肽的溶血机理是其在红细胞质膜上穿孔而形成离子孔道,造成膜结构破坏,引起胞内物质大量渗出,导致溶血,本文以蜂毒肽类似物为目标分子,运用半经验计算法对其溶血活性的定量构效关系分析计算,再利用统计方法进行分子建模,找出影响活性的因素,为进一步预测和设计低溶血活性的蜂毒肽分子,避免表达或合成高副作用的蜂毒肽产物提供量化的理论依据。
1 方法
采用各种理论计算方法和分子图形模拟技术,以计算机为工具,根据累积的大量有关功能分子结构和活性的资料,设计具备某种目标功能的新分子,由于任何分子的生物活性都与它的化学结构密切相关,对目标分子进行结构修饰或改造,有可能使其功能增强、减弱、失活或发生其他改变,定量构效关系(quantitative structure-activity relationship,QSAR)采用数学模型描述分子的生物学活性与结构之间的定量依赖关系,架设分子的化学结构与生物学功能之间的桥梁,在应用上,QSAR能从一系列已知活性的化合物中找出其结构与活性之间的定量关系,进而预测新化合物活性,并指导新功能分子设计,借助多元统计分析方法能够将分子结构描述子和性质联系起来,同时近年来也发展了一些非统计学的方法,如人工神经网络,遗传算法等,本文采用逐步回归与BP神经网络方法分别对蜂毒肽类似物溶血活性进行建模。
选择分别删除了不同单一氨基酸的24个蜂毒肽类似物进行计算,溶血活性参考文献[3],运用Hy-perChem70软件进行分子的量子化学与分子力学计算,用DNAstar分析多肽等电点,共计算了19个参数,采用DPS70统计软件,用上述两种统计方法建模,未特殊指明的参数均为系统默认值。
11 多元线性回归
采用多元线性回归(multiple linear regres-sion,MLR),分析多个自变量与因变量之间的线性关系,设自变量为x1,x2,…,XM,因变量为Y,将一个m元线性回归的数学模型表示为:
Y=bo+b1X1+b2X2+…+bmXm
式中bo为常数项,自变量xj前的系数bj,称因变量Y,对自变量xj的偏回归系数,复相关系数尺为:
R=(SSR/SST)1/2
式中SSR为回归平方和,SST为总的偏差平方和。
12 BP人工神经网络
利用人工神经网络(artificial neural network,ANN)模拟人脑功能的信息处理系统,借鉴人脑神经系统处理信息的过程,并以数学网络连接的拓扑结构作为理论基础,BP(back-propagation)算法由正向传播和反向传播两个过程组成,正向传播的输入信息由输入层经隐含层传向输出层,如果在输出层不能得到期望的输出,则转入反向传播,将误差信息沿原来的连接通路返回,修改各层节点问的连接权重值,如此往复调整网络参数,使之误差函数达到极小为止,在处理实际问题时,利用一组已知的样本构成训练集(输入一输出模式)令其处理,根据一定处理规则调整连接权重,处理结束时,得到1组固定的连接权重值,并将其表达在网络的权重中,利用这组权重,根据未知样本的输入特性参数,可迅速输出预测结果。
2 计算与回归分析
21 参数计算
蜂毒溶血肽分子在HyperChem70中构建,采用MM+分子力场进行几何优化,用AM1力场进行半经验计算,自洽场(SCF)收敛条件为50个迭代,能量差小于001,采用Fletcher-Reeves共轭梯度法收敛,RMSf)、分子键合能(Ebinding)、分子核能(Enuclear)、分子静电能(Ee)、分子最高占据轨道能(EHOMO)、偶极距(Dipole)、分子最低空轨道能(ELUMO)、溶剂可及面积(Surface Area(Grid)),分子体积(Molectilar Volume)、分子范德华面积[Surface Area(Approa)]、水合能(Hydration Energy)、LogP、极化能(Polarizobility)、折光率(Refractivity),分子质量(Mass),EHOMO-ELUMO。
从24个蜂毒肽类似物中抽出17个作为训练集,另外7个作为预测集,以上述17个参数为自变量,HD50的对数Log(C)为因变量,采用DPS75统计软件对所取参数与分子活性的数据进行逐步(stepwise regression)多元线性回归和BP神经网络分析,得到了蜂毒肽类似物的定量构效关系方程,将经上述过程优化过的蜂毒肽及天然蜂毒肽分子用HyperChem70所模拟的分子结构如图1、2所示,优化前蜂毒肽分子近似一种结构紧密的螺旋,分子处于较高能量状态,优化后分子结构相对松驰,分子处于较低能量状态。
22 逐步多元线性回归
从所获得蜂毒肽结构类似物中随机抽出17 本文为全文原貌 未安装PDF浏览器用户请先下载安装 原版全文 个样本,应用DPS75统计软件以溶血活性的对数值标准化后为因变量,17个QSAR参数为自变量进行逐步多元线性回归,选出9个有显著线性关系的变量,得到回归方程,9个结构描述变量与溶血活性数据logHDso见表1。
相关系数R=0888 665,决定系数RR=0799 069,
Y=-1383171+1079E-04X1-5714E-07X2-1072E-04X3+2268-04X4+4048E-04X5-1299E-03X6-7916E-03X7-6144E-01X8-2179E-01X9
其中y表示最小溶血浓度并取其负对数,X1X2,…,9分别表示Total Enerage,Ebinding,Ef,Surface area,Molecular Voltime,Hydration Energy,LooP,Polarizability。
23 BP-神经网络分析
根据DSP75统计软件中的BP神经网络所提供的变换参数建模,建立含一个隐含层的神经网络,输入层为蜂毒肽类似物的9个结构参数,输出层为实验所得HD50的对数值,并将输入和输出归一化到(-11)之间,挑选17个样本为训练集,建立QSAR模型,神经网络的训练终止情况、学习速率、隐含层数和节点数等的选择对网络的学习和预测都有较大影响,作者采用试算法,经多次训练调整,确定蜂毒肽类似物的QSAR模型为含一个隐含层,节点数为9,训练次数1000,目标误差001,学习速率01,学习增长率105,激活函数为Logistic函数的一个1710-1的3层网络拓扑结构。
24模拟统计结果
在24种蜂毒肽类似物中随机挑选17种。利用逐步回归与神经网络建立了QSAR模型,拟合结果见表2以剩余7种类似物为验证集,将变量输入QSAR模型中进行验证,预测结果见表3
3 讨论
由表2、3可见,用逐步线性回归与神经网络建立的QSAR模型得到蜂毒肽类似物溶血参数值HD50,其拟合值及验证值均较理想,图3,图4分别是用两种方法建模所得预测值和观测值的过原点回归曲线,其斜率均接近于1,用未参与建模的6个蜂毒肽类似物进行双侧显著性相关检验,发现4种方法均能在一定程度上使观测值与预测值在001水平上高度相关,表明所建模型正确。
比较表2、3中所列相对误差及图3、4的回归曲线可见,用BP-ANN建立的QSAR非线性模型优于多元线性回归线性模型,说明蜂毒肽类似物由于其相对分子质量大,不同于小分子化合物,且其作用机理也与小分子药物不同,从而使其分子结构与活性之间呈现出某种非线性关系,但BP-ANN近似黑箱操作形式,通过已有数据进行训练,并把记忆的信息存储到连接神经元之间的连接权值上,即将蜂毒肽的溶血活性数据与结构物理参数之间关系的信息存储在神经元连接的权值和阈值上,而建模者却无法从权值和阈值中读取与蜂毒肽活性有关的相关信息,也无法分析哪些因子如何影响多肽活性,所以神经网络也有其不足之处,相对而言,多元线性回归属于开放型统计方法,它可以得出蜂毒肽的各种结构参数的回归系数,使我们知道哪些结构参数对其溶血活性起促进或抑制作用。
由线性回归得到的QSAR方程显示,蜂毒肽类似物表面积及体积对其溶血活性有重要影响,而表面积与活性呈负相关,与体积呈正相关,表明当分子的体积大而面积小时活性高,因此,只有在分子结构为中空管状结构时,才能满足这一要求,本文的计算结果表明,其活性状态的结构应主要为α-螺旋,通过对蜂毒肽的24个氨基酸进行逐个删除,测定观察其抗菌及溶血活性变化发现:除Pro-14外,删除组成两个α-螺旋的任一氨基酸(1-9,13-20)都明显地降低溶血活性,而删除组成“铰链”及C-端氨基酸对溶血活性影响不大,此外,N-端α-螺旋长度较短时,蜂毒肽的溶血活性也会降低,所以,兼性螺旋对溶血活性是必要的,而对抗菌作用并非如此,对蜂毒肽的非对映异构体、顺式和反式对映体的研究证实,非对映异构体蜂毒肽螺旋性很低,不具溶血性,但有抗菌作用,这些前人研究结果都与本模型得到的结论相符。
本文所建QSAR模型显示,醇水分配系数与溶血活性呈正相关,有研究表明,醇能诱导α-螺旋的形成,因为醇能够降低溶剂极性,在低极性环境中,醇的疏水基团与蜂毒肽上的疏水基团相互作用,屏蔽了蜂毒肽与水分子接触,使其与水形成分子间氢键的几率下降,增加了蜂毒肽分子内形成氢键的几率,醇分子在水溶液中一般倾向于形成微团结构,以减少与水的接触面,这种微团结构有可能增加醇分子疏水部位与蜂毒肽的接触面,在醇溶液中的蜂毒肽倾向于形成四聚体,对一些特殊的卤代醇(如HFIP)该作用尤为明显,提高醇水分配系数有利于增加蜂毒肽类似物的活性,从另一方面也说明蜂毒肽在细胞膜上易形成α-螺旋,并以四聚体形式存在,使膜穿孔导致溶血,删去任一疏水性氨基酸对溶血活性都有很大影响,当删去69、1520及13位氨基酸后,使溶血活性下降75%-90%,但删除亲水氨基酸Lys-21和23,则还保留94%和99%的溶血活性,模型还显示,蜂毒肽类似物的分子极性在溶血过程中起重要作用,分子的极化能与活性呈一定的负相关,即分子极性增强时有利于溶血活性下降,因此蜂毒肽C-端的正电荷区有利于与膜结合。
在模型中发现,另外两个能量参数,即分子总能量与水合能也涉及到分子体系的稳定性,能量越高的分子越不稳定,其活性相应下降,在QSAR模型中溶血活性与总体能量成负相关很好地说明了这一问题,分子水合能即水合焓,是物质溶于水后释放的能量,其值越大,溶解度就越大,模型显示它与溶血活性呈正相关,表明蜂毒肽的溶解度增大时,其水溶液中的浓度上升,形成四聚体机会越多,圆二色谱研究已证实,蜂毒肽的单体没有二级结构,4个单体聚集形成四聚体,每个单体疏水面向里,围成一个中心疏水区域,亲水面向外,单体之间相互接触的部位几乎全部是疏水区域,我们推测,当蜂毒溶血肽四聚体在细胞膜上的疏水作用力和各氨基酸基团间的相互吸引与电荷排斥力达到平衡时,其分子构象是有利于溶解破坏膜结构的形式。
综上所述,本文建立的蜂毒肽QSAR模型能够用于预测蜂毒肽类似物的溶血活性,为降低该分子溶血活性,可从以下几方面进行分子设计,1)结构上应避开中空的管状螺旋结构;2)性质上应尽量少用疏水性氨基酸;3)由于分子极性对溶血活性影响很小,但对抑菌活性又必不可少,故可适当增加带正电荷氨基酸比例,利用蜂毒肽类似物生物活性所建立的QSAR模型,可以大大减少筛选高抑菌低溶血蜂毒肽的繁琐程度,降低研究成本,不失为一种寻找和筛选优良活性肽的有效方法。
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说说这款面膜吧,袋子包装还蛮朴实的,奏是喜欢这种简约包装,最近入得好几款神物包装都很简单,所以包装打个9分~lz入得是30片装的,跟50片装的一样,都装在一个袋子里。个人其实比较喜欢独立包装的,因为如果都在一起的话,用了一片其他的都要放在冰箱里面保存啦。不过看在价格这么美丽的份上忍了!用法和其他面膜一样先清洁面部,然后敷上,这款水分不多(PS这里要给有误区的妹子说一下,不是水分越多的面膜,补水效果越好哦,还是要看成分的)譬如这款,所以也不用敷很长时间,10-15分钟就好,时间虽短,但效果卤煮可是用了一片就感受到了,估计这也是他能上电视节目的原因吧。
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使用方法1使用前请先清洁好皮肤。撕开顶部,打开封条(取出面膜后,请再次合上封条)。将面膜敷在合适的位置,10分钟后摘下。2、再次清洗面部(可以不进行此不直接进行后续保养)。(可用清水冲洗,也可以将化妆水导入化妆棉后擦拭)。
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使用心得我经常化妆,因此每天的卸妆很容易就把我眼部肌肤弄的松弛。我差不多一周23次。眼膜刚敷上以后会有一点点熏眼睛和热热的感觉,差不多敷15分钟左右~感觉用几次后,刺痛感跟熏眼睛几乎都不会了。另外眼膜的设计必须赞下,不管是贴下眼周还是法令纹的地方都非常服帖。对于干纹的效果我是有明显感觉的,干纹基本通过这款眼膜密集护理后就极大缓解甚至消除。另外还有很多亲是眼部敷十分钟左右,然后拎下来换一面贴法令纹5分钟~哈哈,比较_丝却也靠谱的方法!最后说下,不管从功效,价格还是其它任何一方面对比起来,在眼膜界蛇毒眼膜必须是首选~用过的人早已如数家珍一盒又一盒
6、脸冻了可以敷面膜吗
如果只是冻红了,可以敷面膜来修复损伤的肌肤,可以适当的给面膜加热后再使用,以免造成面部的二次损伤。如果已经冻伤了甚至破裂了,就不要敷面膜了,以免造成伤口的感染,这个时候要及时就医,用药物来解决面部的冻伤。冻疮并不完全归因于局部受冻,它与全身的温度有着密切关系,因此要注意全身保暖,全身火力充足局部肌体血液才会流动顺畅,不要怕难看,一定要保暖,大冬天要做到,静则不冷,动则发热的保暖水平。
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针对轻熟龄肌肤人,针对女性皮肤问题进行深层修护、调节平衡。2013年7月进驻中国丝芙兰,我第一次接触这个品牌也是在丝芙兰打折的时候凑单买的,当时还没听说过这个牌子,就买了三种一组合的试用一下!结果一用就控制不住回购呀。
这款面膜一共三种,一种是蜂毒多肽抗皱面膜,改善暗黄,干燥,细纹,增加皮肤弹性,因为有蜂毒的成分,所以敷上微微疼痛是正常的,这款我用的最少了,因为我觉得涂抹面膜主要想用清洁的,所以后两种买的多。
第二种是双重亮肤红糖面膜,这款主打去角质的,用完脸超级嫩!超级滑!它的质地有类似Fresh的黄糖面膜,有磨砂,但是很温和,使用感超级好,洗净之前微微按摩可以更深入的清洁!还有最后一个就是最有名的三层纹理红景天面膜啦,红景天的作用就是深层的净化提亮肤色,用高岭土作为泥浆载体,超有吸附力的!一洗完脸就会觉得肤色亮了!
这种涂抹面膜尤其是现在冬天,天气太干,很容易脸绷感觉,不太好,所以我会搭配欧提丽的喷雾,敷之前喷一下,如果稍微觉得干了继续喷喷喷,哈哈,最后洗脸的时候可以先用温水打湿,再用化妆棉把面膜擦掉再洗净就好啦!而且它自带的面膜刷一点都不鸡肋。
第一眼感觉还觉得没啥特别的,一用就知道了,很柔软不扎脸,并且不掉毛,一支可以一直用,洗干净晾干就好了。还有一种用法就是三天连续敷,第一天红糖,第二天红景天,第三天用蜂毒,可以达到水油平衡,毛孔清透的状态~会一直回购的~丝芙兰打八折买最合算啦!
人类社会利用蜂毒的历史悠久,同时人们对蜂毒和蜂毒肽的研究也在不断深入。自从1952 年Neuman等人用电泳法分离获得蜂毒肽以来,关于蜂毒肽的研究拉开了帷幕,很多研究发现蜂毒肽对体内外多种肿瘤细胞都有杀伤作用。
1972 年,Haberman报道1 μmol/L 的蜂毒肽就能阻止肿瘤细胞增殖但却不抑制正常细胞的生长与克隆率。
1996 年,Arora通过对正常大鼠肝细胞与大鼠肝癌细胞抗缺氧损伤能力的实验对比,证实蜂毒肽激活磷脂酶 A2(PLA2)能够解除肝癌细胞对缺氧的抵抗。Dunn 等将来自于鼠抗人骨髓瘤细胞和淋巴瘤细胞表面特异蛋白的抗体 SCFV 基因同蜂毒肽基因相融合,构建了能杀肿瘤细胞的抗毒素基因,大肠杆菌中融合基因并表达,精制的抗毒素显示了体外杀死肿瘤细胞的效能 。
1999 年, Kubo 等通过 5 种细胞毒的测定方法对蜂毒肽与嗜酸性粒细胞的主要碱性蛋白进行比较,结果证实蜂毒肽能插入 K562 细胞的胞膜中进而形成孔道,引起 Ca2+内流,使胞内 Ca2+浓度升高,细胞裂解,最后导致在 1 h 内蜂毒肽对实验的白血病细胞均具杀伤效果。同年,Shamsher 等研究发现蜂毒肽可激活磷酸脂酶 D 进而裂解人单核白血病细胞(U937)。
2001年,黄雪强等[6]通过人白血病细胞观察蜂毒肽促凋亡的作用,结果发现对白血病细胞 5 mg/mL 蜂毒肽作用 4 h 与4μg/mL 蜂毒肽作用24h 都可见典型凋亡特征,进一步实验发现其诱导细胞凋亡同 bcl-2 基因表达显著下降相关。
2003年,刘岭等通过MTT 法对 SMMC-7721、BEL-7402 和 Hep-3B 三种肝癌细胞系进行研究,考察蜂毒肽抑制肿瘤的量效关系,结果显示:在 8~64 μg/mL 剂量时,蜂毒肽的抑瘤率直线上升,在体外表现显著的抗瘤效果。据此推测,可能与在高浓度中蜂毒肽的自聚集相关,高浓度下多呈四聚体的状态,与单体相比更能与细胞膜有效地结合,进而形成离子通道,改变胞膜通透性,裂解胞膜,表现出极强的体外杀伤肿瘤的效果。2004年,陈永强等利用不同浓度的蜂毒肽对敏感细胞系 U2OS 进行处理,64 mg/L 时对 U2OS 分别作用12 h 和24 h,其坏死率高达 80 %以上,而 16 mg/L 与 32 mg/L 剂量时对细胞增殖有显著抑制效果,还能够诱导细胞凋亡及坏死。Don Rivett 博士领导的分子生物学研究小组对蜂毒肽抗癌作用进行了研究,研发出以蜂毒肽为“弹头”的抗毒素,对前列腺癌、乳腺癌、膀胱癌都具很好的疗效。
2009年8月11日英国《每日邮报》报道,日前美国华盛顿大学的科学家公布一项有意义的研究成果——他们借助纳米技术,开发出一种在显微镜下才能看到的“纳米蜜蜂”。“小蜜蜂”能钻进癌细胞,释放出杀癌良药,将癌细胞一个个消灭掉。而小蜜蜂比人的发丝还要小几千倍。 “小蜜蜂”背上有一个特殊的包裹,包裹里装的是令常人闻之色变的蜂毒肽。研究人员称,蜂毒肽是非常好的杀癌良药。“小蜜蜂”内部还有专门的定位物质,能够指引它一路前行,直达患处。在实验中,纳米蜜蜂”已经令患有乳腺癌的小白鼠体内的癌细胞减少了45%,而患有皮肤癌的小白鼠体内的癌细胞则锐减了75%之多。
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