流式细胞仪亚二倍体凋亡峰怎么分析

1) PS（磷脂酰丝氨酸）在细胞外膜上的检测：PS从细胞膜内侧转移到外侧在细胞受到凋亡诱导后不久发生，可能作为免疫系统的识别标志。AnnexinV，一个钙依赖性的磷脂结合蛋白，能专一性的结合暴露在膜外侧的PS，再通过简单的显色或发光系统进行检测。由于这是一种凋亡早期的活细胞检测（悬浮细胞和贴壁细胞都适用），可与DNA染料或别的晚期检测方法相结合来标记凋亡的发展阶段。
美国著名生物试剂公司CLONTECH和Invitrogen公司分别开发了多种标记的Annexin
V产品，简便快速，10分钟就可完成检测。其中带荧光标记的Annexin V-EGFP（Enhanced Green Fluorescent
Protein）及Annexin V-FITC，灵敏度高，可作为FACS（流式细胞分选）方法筛选凋亡细胞的基础。由于融合蛋白Annexin
V-EGFP，EGFP与PS 的结合比例为1：1，还可进行定量检测。除此之外，还提供生物素偶联的Annexin
V，可通过常用的酶联显色反应来检测。另外，MACS公司将磁珠包被Annexin V，可采用磁分选方法筛选凋亡细胞。
2)细胞内氧化还原状态改变的检测：
这反应了细胞凋亡研究中相对较新的趋势，研究什么样的氧化还原环境引起下游事件的发生。CLONTECH公司的ApoAlertTM
GlutathioneDetection
Kit通过荧光染料monochlorobimane（MCB）体外检测凋亡细胞细胞质中谷光苷肽的减少来检测凋亡早期细胞内氧化还原状态的变化。正常状态下，谷光苷肽（glutathione：GSH）作为细胞的一种重要的氧化还原缓冲剂。细胞内有毒的氧化物通过被GSH还原而定期去除，氧化型的GSH又可被GSH还原酶迅速还原。这一反应在线粒体中尤为重要，许多呼吸作用中副产物的氧化损伤将由此被去除。在Jurcat和一些其它类型的细胞中，细胞膜中有可被凋亡信号启动的ATP依赖的GSH转移系统。当细胞内GSH的排除非常活跃时，细胞液就由还原环境转为氧化环境，这可能导致了凋亡早期细胞线粒体膜电位的降低，从而使细胞色素C（三羧酸循环中的重要组分）从线粒体内转移到细胞液中，启动凋亡效应器caspase的级联反应。
由于 GSH与氧化还原作用及线粒体功能密切相关，此项检测除了对研究细胞凋亡的起始非常有用外，还可用于心脏病、中风等疾病治疗的研究。但有些细胞如：HeLa 和3T3细胞凋亡时没有明显的GSH水平的变化，不能用此法检测。
3)细胞色素C的定位检测
细胞色素C作为一种信号物质，在细胞凋亡中发挥着重要的作用。正常情况下，它存在于线粒体内膜和外膜之间的腔中，凋亡信号刺激使其从线粒体释放至细胞液，结合Apaf-1
（apoptoticprotease activating
factor-1）后启动caspase级联反应：细胞色素C/Apaf-1复合物激活caspase-9，后者再激活caspase-3和其它下游caspase。细胞色素C氧化酶亚单位Ⅳ（cytochrome c oxidase subunit Ⅳ：COX4）是定位在线粒体内膜上的膜蛋白，凋亡发生时，它保留在线粒体内，因而它是线粒体富集部分的一个非常有用的标志。
ApoAlertTMCell Fractionation Kit不用超离心，可从凋亡和非凋亡细胞中快速有效分离出高度富集的线粒体部分，再进一步通过Western杂交用细胞色素C抗体和COX4抗体标示细胞色素C和COX4的存在位置，从而判断凋亡的发生。
4) 线粒体膜电位变化的检测：
在凋亡研究的早期，从形态学观测上线粒体没有明显的变化。随着凋亡机制研究的深入，发现线粒体凋亡也是细胞凋亡的重要组成部分，发生很多生理生化变化。例如，在受到凋亡诱导后线粒体转膜电位会发生变化，导致膜穿透性的改变。MitoSensorTM，一个阳离子性的染色剂，对此改变非常敏感，呈现出不同的荧光染色。正常细胞中，它在线粒体中形成聚集体，发出强烈的红色荧光。凋亡细胞中，因线粒体穿膜电位的改变，它以单体形式存在于细胞液中，发出绿色荧光。用荧光显微镜或流式细胞仪可清楚地分辨这两种不同的荧光信号。CLONTECH公司的ApoAlert
Mitochondrial Membrane Sensor
Kit就采用这种原理来检测线粒体膜电位的变化。但是，这种方法不能区分细胞凋亡或其他原因导致的线粒体膜电位的变化。
细胞凋亡晚期中，核酸内切酶（某些Caspase的底物）在核小体之间剪切核DNA，产生大量长度在180-200 bp
的DNA片段。对于这一现象的检测通常有以下两种方法：
1) TUNEL（Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end-labeling）
通过DNA末端转移酶将带标记的
dNTP
（多为dUTP）间接（通过地高辛）或直接接到DNA片段的3’-OH端，再通过酶联显色或荧光检测定量分析结果。美国Intergen公司提供多种标记方法，直接荧光标记，地高辛介导荧光标记或过氧化物酶联显色，可做细胞悬液、福尔马林固定或石蜡处理的组织、细胞培养物等多种样本的检测。其中，直接标记步骤少，操作简便。而间接标记有信号放大的作用，检测灵敏度高。
2) LM-PCR Ladder （连接介导的PCR检测）
当凋亡细胞比例较小以及检测样品量很少（如活体组织切片）时，直接琼脂糖电泳可能观察不到核DNA的变化。CLONTECH公司的ApoAlertLM-PCR
Ladder Assay Kit通过LM-PCR（ligation-mediated
PCR），连上特异性接头，专一性地扩增核小体的梯度片段，从而灵敏地检测凋亡时产生的核小体的梯度片段。此外，LM-PCR
检测是半定量的，因此相同凋亡程度的不同样品可进行比较。
上述两种方法都针对细胞凋亡晚期核DNA断裂这一特征，但细胞受到其它损伤（如机械损伤，紫外线等）也会产生这一现象，因此它对细胞凋亡的检测会受到其它原因的干扰。
3) Telemerase Detection （端粒酶检测）
这是相对来说推出较早，用得较多的一种方法。端粒酶是由RNA和蛋白组成的核蛋白，它可以自身RNA为模板逆转录合成端粒区重复序列，使细胞获得“永生化”。正常体细胞是没有端粒酶活性的，每分裂一次，染色体的端粒会缩短，这可能作为有丝分裂的一种时钟，表明细胞年龄、复制衰老或细胞凋亡的信号。研究发现，90%以上的癌细胞或凋亡细胞都具有端粒酶的活性。Invitrogen公司的TRAP-eze
Telemerase Detection
Kit在1996年率先推出。它提供特定的寡核苷酸底物，分别与底物及端粒重复序列配对的引物。如果待测样本中含有端粒酶活性，就能在底物上接上不同个数的6碱基（GGTTAG）端粒重复序列，通过PCR反应，产物电泳检测就可观察到相差六个碱基的DNA
Ladder现象（参见图4）。此外，Intergen公司还提供用酶联免疫法（ELISA）检测的试剂盒
同样，这种检测方法也不专对细胞凋亡，检测结果也不纯反应细胞凋亡的发生。 根据凋亡细胞固有的形态特征，人们已经设计了许多不同的细胞凋亡形态学检测方法。
1．光学显微镜和倒置显微镜
1． 未染色细胞：凋亡细胞的体积变小、变形，细胞膜完整但出现发泡现象，细胞凋亡晚期可见凋亡小体。
贴壁细胞出现皱缩、变圆、脱落。
2． 染色细胞：常用姬姆萨染色、瑞氏染色等。凋亡细胞的染色质浓缩、边缘化，核膜裂解、染色质分割
成块状和凋亡小体等典型的凋亡形态。
2．荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜
一般以细胞核染色质的形态学改变为指标来评判细胞凋亡的进展情况。
常用的DNA特异性染料有：HO 33342 (Hoechst 33342），HO 33258 (Hoechst 33258),DAPI。三种染料与　DNA的结合是非嵌入式的，主要结合在DNA的A-T碱基区。紫外光激发时发射明亮的蓝色荧光。
Hoechst是与DNA特异结合的活性染料，储存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度，使用时用PBS稀释成终浓度为2~5mg/ml。
DAPI为半通透性，用于常规固定细胞的染色。储存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度，使用终浓度一般为05 ~1mg/ml。
结果评判：细胞凋亡过程中细胞核染色质的形态学改变分为三期：Ⅰ期的细胞核呈波纹状（rippled）或呈折缝样（creased），部分染色质出现浓缩状态；Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；Ⅱb期的细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。
3．透射电子显微镜观察
结果评判：凋亡细胞体积变小，细胞质浓缩。凋亡Ⅰ期（pro-apoptosis nuclei）的细胞核内染色质高度盘绕，出现许多称为气穴现象（cavitations）的空泡结构；Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；细胞凋亡的晚期，细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。

细胞凋亡在胚胎发育、造血、免疫系统的成熟以及维护正常组织和器官的细胞恒定与生长平衡，乃至机体衰老方面都起着重要作用。因此，有关凋亡的研究在临床和基础等各个领域已经广泛开展,凋亡细胞的检测方法显得非常重要。流式细胞仪(
Flow cytometry ,FCM)
将流体喷射技术、激光光学技术、电子技术和计算机技术等集于一体,较其它方法有不可比拟的优越性，既可定性又可定量,且具有简单、快速和敏感性高的特点,可进行多参数和活体细胞分析。在APO
的研究得到较为广泛的应用，开辟了新途径。
1 光散射法
在FCM
系统中，被检细胞在液流中通过仪器测量区时,经激光照射,细胞向空间360°立体角的所有方向散射光线,其中前向散射光( FSC)
的强度与细胞大小有关,而侧向散射光(SSC)
的强度与质膜和细胞内部的折射率有关。细胞凋亡时,细胞固缩,体积变小,核碎裂形成,细胞内颗粒往往增多,故凋亡细胞FSC 降低而SSC
增高。细胞坏死由于胞体肿胀,细胞核亦碎裂分解故FSC 和SCC 均增高。正常细胞FSC 高而SSC
低。根据光散射特性检测凋亡细胞最主要的优点是可以将光散射特性与细胞表面免疫荧光分析结合起来,用以区别辩认经这些特殊处理发生选择凋亡的淋巴细胞亚型,也可用于活细胞分类。值得注意的是,根据FSC
和SSC
判断凋亡细胞的可靠性受被测细胞形态上的均一性和核细胞浆比率影响很大,因此在某些淋巴细胞凋亡中,用光散射特性检测凋亡的可靠性较好而在肿瘤细胞凋亡中其可靠性较差。
2细胞DNA 含量的测定
细胞凋亡时,核酸内切酶激活,导致DNA
断裂,这是凋亡的特征性表现,也为FCM 鉴别凋亡细胞奠定了基础。而检测细胞凋亡DNA 断裂的方法中,最常用、最简便的就是细胞DNA
含量分析。当细胞用乙醇、TrtionX—100 处理后细胞膜上出现漏洞,小片段DNA 从细胞内释放出来,使其DNA
含量低于正常细胞的二倍体。用碘化丙啶( PI) 染色后分析,可在二倍体C0/ G1 ,峰前出现“亚二倍体”峰,即细胞凋亡峰(APO峰)
,根据APO 峰可测出凋亡细胞百分率,该法简单易行,可大批定量检测凋亡标本,亦可同时分析细胞的细胞周期位置。另外,应用FCM 方法通过对DNA
和RNA 的联合检测可以鉴别出G0 期细胞,因此,可分析细胞凋亡与G1 或G0 细胸的关系。DNA
降解的程度取决于凋亡的阶段、细胞的类型和凋亡诱发因子的特性。染色过程中DNA 的逸出量变化也影响FCM
检测结果。据研究,将高浓度的磷酸盐———枸椽酸盐缓冲液加入漂洗液中,可增高降解DNA 的逸出量,从而提高鉴别凋亡细胞与正常细胞的能力。
DNA
含量测定在检测细胞凋亡中的局限性在于其特异性和敏感性均不高。特异性不高是因为APO 峰代表了一组细胞群体,包括凋亡细胞、机械损伤细胞、低DNA
含量的细胞或不同染色体结构的细胞,在上述情况下,DNA
与荧光染料的结合量均小。另外,非固定的细胞在低渗溶液中被溶解时,可导致大量的核碎片出现,此时APO
峰的细胞数目只代表了核碎片的数目,并不代表凋亡细胞数目。敏感性较差的原因是细胞凋亡早期只有DNA 断裂点出现,但尚未出现DNA
片段的大量丢失,所以该法不能检出早期凋亡细胞和发生于S 期或G2/ M 期的凋亡细胞,因为其实际含量不低于二倍体细胞所含的DNA
,因此该法进行凋亡细胞分析时应结合其它形态或生化方法,以期更准确地分析细胞的凋亡状态。
3Y 啶橙染色法( Acridine Orange ,AO)
AO
可将细胞或细胞核中的双链DNA 和变性DNA 染成不同颜色的荧光。AO 插入双链DNA
中时,发绿色荧光;AO也可与单链或通过变性而产生的DNA 单链发生作用,这时发出红色荧光,因此,通过FCM
检测不同的荧光,可判断凋亡的发生。在测定被标准化后,绿色和红色荧光强度的量与总DNA 含量成比例,红色荧光与总体细胞(红色加绿色)
荧光的比率表示细胞中变性DNA 的比例,因此,这种方法可用于评价DNA 对原位变性的敏感性。有时候,凋亡细胞DNA 降解不明显,依赖于DNA
降解来检测细胞凋亡的方法如细胞DNA含量测定、DNA 末端标记等就难以检测到细胞凋亡变化。AO法检测凋亡的原理不依赖于DNA
片断的产生,因此其最主要的优点是可应用于寡核小体片段与凋亡不相平衡等情况,但AO 染色法不能有效区分有丝分裂细胞和凋亡细胞。
4若丹明( Rh123) 染色法
细胞生活状态下,胞膜上的钠-
钾泵、钙泵等的作用,使细胞膜内外维持着不同离子的浓度梯度,包括Na + , K+ ,Cl - ,Ca2 + 等,形成细胞膜电位。FCM
可以检测亲脂性离子荧光染料在胞膜内外的分布,来测量膜电位的高低,以评价细胞的活力。Rh123
是一种亲脂性阳离子荧光染料,对细胞膜具有通透性,线粒体膜尤敏感。细胞存活状态时,若丹明123
通过细胞膜,积聚于线粒体发出绿色荧光。在细胞凋亡时,线粒体膜的转运能力下降,电负性降低,故细胞线粒体积聚Rh123
的能力也丧失,荧光强度降低,据此检测细胞的凋亡变化。但应指出,在凋亡的早期阶段,由于胞膜尚完整,大多数细胞器和细胞功能相对较好,因此,Rh123
法对于早期凋亡细胞和活细胞的鉴别比较困难。
5原位末端标记技术
细胞凋亡时,DNA 断裂早于形态学改变及DNA
含量减少,原位末端标记( ISEL) 是将渗入到凋亡细胞中的外源性核苷酸在酶和DNA
的催化下与凋亡细胞因内源性核酸酶的激活而产生的单股或双股断裂相结合,较前述方面具更高灵敏性。通常有两种方法: ①DNA 聚合酶I 或klenow
大片段介导的单位缺口平移( INST) ; ②末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP 缺口末端标记( TUNEL) 。
INST
是利用DNA 多聚酶将核苷酸整合到凋亡细胞内断裂的DNA 处的3’末端,同时水解5’末端,以修复DNA
,若使用已标记的核苷酸即可显示出有断裂DNA 的细胞。1993 年,Gorczyca 等提出了末端脱氧核糖核酸转移酶( TdT)
标记法采检测凋亡细胞的DNA 断裂,此种方法已得到广泛应用。由于内源性核酸内切酶激活,细胞自身的染色质或DNA 被切割,并产生与DNA
断点数目相同的3’2 羟基末端, TdT 可以将生物素化的dUTP 标记至3’2 羟基末端,通过卵白素2FITC 系统,使DNA
的断点部位发生特异荧光而签别出凋亡细胞,TdT 末端标记法是鉴别凋亡细胞比较特异的一种方法。脑组织中的凋亡细胞很少,因此基因组DNA
片断需要更灵敏的检测技术。将TUNEL 法与FCM 结合起来可以提高检测凋亡细胞中DNA
片断的灵敏度。经凋亡诱导因子处理一定时间后的细胞,原位末端标记的凋亡比Hoechst33342 染色显示的要多,提示TUNEL
可检测出尚未出现明显凋亡形态学特征但已发生DNA 裂解的核,从而使检测的灵敏度提高。对比研究表明, TUNEL 的敏感性远远高于ISNT
,尤其在APO早期TUNEL 法阳性率较高,可能是APO 发生时DNA 多数为双链同时断裂,单链少见的原因。后者是依赖DNA
多聚酶介导的修复反应,故ISNT 的阳性率相对较低。TUNEL 还可结合细胞同期的分析,可同时了解凋亡细胞DNA
断裂和细胞周期分布之间的关系,近来已成为鉴别和定量凋亡细胞的最常用方法之一。但由于断裂DNA
的标记过程比较复杂,涉及多种因素,所以末端标记的阴性结果并不一定代表DNA链的完整,应排除方法上的问题,如TdT
酶活力的丧失等诸多影响因素。因此应用TdT 末端标记法鉴别凋亡细胞必须同时设阳性及阴性对照组,以便得到可靠结果。
6Annexin V/ PI 法
1992 年Fadok 报道在APO 早期位于细胞膜内侧的磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserin
,PS) 迁移至细胞外侧,这一现象出现在核染色质变性与核体积缩小之前。AnnexinV
是一种具有很强的抗凝血特性的血管蛋白,和磷脂有高亲合力,尤其与带负电荷的磷脂如PS 具极强的结合力,利用其特性可以检测细胞凋亡。但坏死细胞PS
亦暴露于外表使Annexin V 结合阳性,因此使用Annexin V 这一参数不能区分坏死或凋亡,必须同时采用PI
这一参数将坏死细胆区分开来。FCM 通过Annexin V —FITC 标志暴露于细胞膜上的PS 结合PI 进入损伤细胞膜标记降解DNA
分析凋亡与坏死细胞。在检测时有4个亚群包括机械性损伤细胞(Annexin - / P1 + ) 、正常细胞(An2nexin - / PI - )
、凋亡细胞(Annexin + / PI - ) 和继发性坏死细胞(Annexin + / PI + ) 被区分。Boersma
等应用Ampexin V2FITE染色法检测细胞毒药物处理后的中国仓鼠细胞凋亡变化,FCM
检测发现荧光信号强弱不同的两种细胞亚群。进一步形态学等证实弱荧光细胞亚群代表早期凋亡细胞,强荧光亚群代表晚期凋亡细胞,可见其是检测和定量凋亡细胞的一种较为可靠的方法。细胞凋亡时膜上PS
外露早于DNA 断裂发生,因此该法检测早期凋亡更为灵敏,且该法不需要固定细胞,避免了PI 法因固定造成的细胞碎片过多及TUNEL
法因固定出现的DNA 片段丢失,因此更加省时,结果亦更可靠,是目前最为理想的凋亡定量检测方法。
7其　他
71ssDNA
单抗法　把抗单链DNA(ssDNA) 单克隆抗体用于细胞凋亡的检测,是一种偶然发现,因为在应用ssDNA 单抗(荧光法)
检测细胞毒性药物诱导DNA 损伤中,观察到凋亡的白血病细胞(MOL T24) 有较强的荧光,后来经过适当的改进,证明ssDNA
单抗可以特异地识别凋亡细胞。与TUNEL法相比,ssDNA 具有更强的灵敏性。TUNEL
法检测的凋亡细胞可能只是单抗法检测的凋亡细胞中的一个亚类。ssDNA法检测APO 一般用免疫荧光法。但也可和FCM
结合应用。单抗法使用简便、成本低、应用广泛。ssDNA
单抗可以区别坏死和凋亡、甚至能检测前期凋亡,凋亡后坏亡和一些特殊的凋亡形式(如无片段化的细胞凋亡) 。因此, ssDNA
单抗法可望成为一种新的特异灵敏检测细胞凋亡的方法。
72
　细胞凋亡的相关蛋白分析　研究发现,有不少基因参加凋亡调控,这些基因产物可参与促进或抑制APO
的发生、发展,因此检测凋亡调节基因蛋白对研究APO 及其调控有重要作用。迄今为止,已可对大量细胞凋亡调节基因的蛋白产物分析,如P53
蛋白、caspases、C2myc、Fas 抗原、TNF、bcl22 家族蛋白、cyclin、ras 等。FCM
用荧光标记的各种调控蛋白单抗染色,收集不同波长的荧光信号,检测细胞膜表面或细胞内荧光分子数量,可以了解每个细胞的变化,而且所需样品少,方法简便、快捷、准确。
8展　望
近几年来,随着FCM
技术的不断发展和APO 研究的逐渐深入,FCM 在细胞凋亡研究中日益广泛。应用FCM
定量检测凋亡细胞简便、快速、客观,并可进行多参数检测,因此,可同时对APO
及其相关的癌基因表达、细胞周期分布等诸多因素进行相关分析,可以比较深入地了解凋亡的调节机制。尽管应用FCM
进行细胞凋亡研究的方法较多,但FCM检测凋亡细胞的方法一般基于细胞凋亡过程中形态、生化等某一方面的特性,因而难于了解凋亡过程中发生的各种变化的相互关系,也使该类方法缺乏特异性,所以,联合应用多种针对不同特性的FCM
检测方法,才能更为有效地鉴别凋亡细胞。同时,FCM
研究结果尚需同时结合形态学观察或生物化学方法,才能更加深入地了解凋亡细胞的生物学特性。随着生物技术的发展及人们对APO
本质认识的深入,相信在不久的将来,定会有更为特异和敏感的方法问世,有助于细胞凋亡取得突破性进展。