R语言进行最小显著性差异分析 （LSD）

形式如下：

输出文件如下

#读入数据

china <- readtable("F:\\2008年我国其中31个省、市和自治区的农村居民家庭平均每人全年消费性支出txt",header=TRUE)

distance <- dist(china) #计算距离

chinahc <- hclust(distance) #聚类分析,最长距离法

plot(chinahc, hang = -1) #绘画系谱图

re <- recthclust(chinahc, k = 5) #分为5类

re

for (i in 1:5) {

print(paste("第",i,"类"))

print(china[re[[i]],]$地区)

下游分析

cellranger count 计算的结果只能作为错略观测的结果，如果需要进一步分析聚类细胞，还需要进行下游分析，这里使用官方推荐 R 包（Seurat 30）

流程参考官方外周血分析标准流程（ https://satijalaborg/seurat/v30/pbmc3k_tutorialhtml ）

Rstudio操作过程：

## 安装seurat

installpackages('Seurat')

## 载入seurat包

library(dplyr)

library(Seurat)

## 读入pbmc数据（文件夹路径不能包含中文，注意“/“的方向不能错误，这里读取的是10x处理的文件，也可以处理其它矩阵文件，具体怎样操作现在还不知道，文件夹中的3个文件分别是：barcodestsv，genestsv，matrixmtx，文件的名字不能错，否则读取不到）

pbmcdata <- Read10X(datadir = "D:/pbmc3k_filtered_gene_bc_matrices/filtered_gene_bc_matrices/hg19/")

## 查看稀疏矩阵的维度,即基因数和细胞数

dim(pbmcdata)

pbmcdata[1:10,1:6]

## 创建Seurat对象与数据过滤，除去一些质量差的细胞（这里读取的是单细胞 count 结果中的矩阵目录；在对象生成的过程中，做了初步的过滤；留下所有在>=3 个细胞中表达的基因 mincells = 3；留下所有检测到>=200 个基因的细胞 mingenes = 200。)

pbmc <- CreateSeuratObject(counts = pbmcdata, project = "pbmc3k", mincells = 3, minfeatures = 200)

pbmc

##计算每个细胞的线粒体基因转录本数的百分比（%）,使用[[ ]] 操作符存放到metadata中，mit-开头的为线粒体基因

pbmc[["percentmt"]] <- PercentageFeatureSet(pbmc, pattern = "^MT-")

##展示基因及线粒体百分比（这里将其进行标记并统计其分布频率，"nFeature_RNA"为基因数，"nCount_RNA"为细胞数，"percentmt"为线粒体占比）

VlnPlot(pbmc, features = c("nFeature_RNA", "nCount_RNA", "percentmt"), ncol = 3)

plot1 <- FeatureScatter(pbmc, feature1 = "nCount_RNA", feature2 = "percentmt")

plot2 <- FeatureScatter(pbmc, feature1 = "nCount_RNA", feature2 = "nFeature_RNA")

CombinePlots(plots = list(plot1, plot2))

## 过滤细胞：根据上面小提琴图中基因数"nFeature_RNA"和线粒体数"percentmt"，分别设置过滤参数，这里基因数 200-2500，线粒体百分比为小于 5%，保留gene数大于200小于2500的细胞；目的是去掉空GEMs和1个GEMs包含2个以上细胞的数据；而保留线粒体基因的转录本数低于5%的细胞,为了过滤掉死细胞等低质量的细胞数据。

pbmc <- subset(pbmc, subset = nFeature_RNA > 200 & nFeature_RNA < 2500 & percentmt < 5)

## 表达量数据标准化,LogNormalize的算法：A = log( 1 + ( UMIA ÷ UMITotal ) × 10000

pbmc <- NormalizeData(pbmc, normalizationmethod = "LogNormalize", scalefactor = 10000)

#pbmc <- NormalizeData(pbmc) 或者用默认的

## 鉴定表达高变基因(2000个）,用于下游分析,如PCA；

pbmc <- FindVariableFeatures(pbmc, selectionmethod = "vst", nfeatures = 2000)

## 提取表达量变化最高的10个基因；

top10 <- head(VariableFeatures(pbmc), 10)

top10

plot1 <- VariableFeaturePlot(pbmc)

plot2 <- LabelPoints(plot = plot1, points = top10)

CombinePlots(plots = list(plot1, plot2))

plot1<-VariableFeaturePlot(object=pbmc)

plot2<-LabelPoints(plot=plot1,points=top10,repel=TRUE)

CombinePlots(plots=list(plot1,plot2))

## PCA分析：

# PCA分析数据准备,使用ScaleData()进行数据归一化；默认只是标准化高变基因（2000个）,速度更快,不影响PCA和分群,但影响热图的绘制。

#pbmc <- ScaleData(pbmc,varstoregress ="percentmt")

## 而对所有基因进行标准化的方法如下：

allgenes <- rownames(pbmc)

pbmc <- ScaleData(pbmc, features = allgenes)

pbmc <- ScaleData(pbmc, varstoregress = "percentmt")

## 线性降维（PCA）,默认用高变基因集,但也可通过features参数自己指定；

pbmc <- RunPCA(pbmc, features = VariableFeatures(object = pbmc))

## 展示 pca 结果（最简单的方法）

DimPlot(object=pbmc,reduction="pca")

## 检查PCA分群结果, 这里只展示前5个PC,每个PC只显示5个基因；

print(pbmc[["pca"]], dims = 1:5, nfeatures = 5)

##PC_ 1 

##Positive:  RPS27, MALAT1, RPS6, RPS12, RPL13 

##Negative:  CSTA, FCN1, CST3, LYZ, LGALS2 

##PC_ 2 

##Positive:  NKG7, GZMA, CST7, KLRD1, CCL5 

##Negative:  RPL34, RPL32, RPL13, RPL39, LTB 

##PC_ 3 

##Positive:  MS4A1, CD79A, BANK1, IGHD, CD79B 

##Negative:  IL7R, RPL34, S100A12, VCAN, AIF1 

##PC_ 4 

##Positive:  RPS18, RPL39, RPS27, MALAT1, RPS8 

##Negative:  PPBP, PF4, GNG11, SDPR, TUBB1 

##PC_ 5 

##Positive:  PLD4, FCER1A, LILRA4, SERPINF1, LRRC26 

##Negative:  MS4A1, CD79A, LINC00926, IGHD, FCER2 

## 展示主成分基因分值

VizDimLoadings(pbmc, dims = 1:2, reduction = "pca")

## 绘制pca散点图

DimPlot(pbmc, reduction = "pca")

## 画第1个或15个主成分的热图；

DimHeatmap(pbmc, dims = 1, cells = 500, balanced = TRUE)

DimHeatmap(pbmc, dims = 1:15, cells = 500, balanced = TRUE)

## 确定数据集的分群个数

# 鉴定数据集的可用维度，方法1：Jackstraw置换检验算法；重复取样（原数据的1%）,重跑PCA,鉴定p-value较小的PC；计算‘null distribution’(即零假设成立时)时的基因scores。虚线以上的为可用维度，也可以调整 dims 参数，画出所有 pca 查看。

#pbmc <- JackStraw(pbmc, numreplicate = 100)

#pbmc <- ScoreJackStraw(pbmc, dims = 1:20)

#JackStrawPlot(pbmc, dims = 1:15)

# 方法2：肘部图（碎石图）,基于每个主成分对方差解释率的排名。

ElbowPlot(pbmc)

## 细胞聚类：分群个数这里选择10,建议尝试选择多个主成分个数做下游分析,对整体影响不大；在选择此参数时,建议选择偏高的数字（为了获取更多的稀有分群,“宁滥勿缺”）；有些亚群很罕见,如果没有先验知识,很难将这种大小的数据集与背景噪声区分开来。

## 非线性降维（UMAP/tSNE)基于PCA空间中的欧氏距离计算nearest neighbor graph,优化任意两个细胞间的距离权重（输入上一步得到的PC维数） 。

pbmc <- FindNeighbors(pbmc, dims = 1:10)

## 接着优化模型,resolution参数决定下游聚类分析得到的分群数,对于3K左右的细胞,设为04-12 能得到较好的结果(官方说明)；如果数据量增大,该参数也应该适当增大。

pbmc <- FindClusters(pbmc, resolution = 05)

## 使用Idents（）函数可查看不同细胞的分群；

head(Idents(pbmc), 5)

## 结果：AAACCTGAGGTGCTAG    AAACCTGCAGGTCCAC    AAACCTGCATGGAATA AAACCTGCATGGTAGG      AAACCTGCATTGGCGC 

               1                3                0               10                2 

Levels: 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

## Seurat提供了几种非线性降维的方法进行数据可视化（在低维空间把相似的细胞聚在一起）,比如UMAP和t-SNE,运行UMAP需要先安装'umap-learn'包，这里不做介绍，两种方法都可以使用，但不要混用，如果混用，后面的结算结果会将先前的聚类覆盖掉，只能保留一个。

## 这里采用基于TSNE的聚类方法。

pbmc <- RunTSNE(pbmc, dims = 1:10)

## 用DimPlot()函数绘制散点图,reduction = "tsne",指定绘制类型；如果不指定,默认先从搜索 umap,然后 tsne, 再然后 pca；也可以直接使用这3个函数PCAPlot()、TSNEPlot()、UMAPPlot()； cols,ptsize分别调整分组颜色和点的大小；

DimPlot(pbmc,reduction = "tsne",label = TRUE,ptsize = 15)

## 这里采用基于图论的聚类方法

pbmc<-RunUMAP(object=pbmc,dims=1:10)

DimPlot(object=pbmc,reduction="umap")

## 细胞周期归类

pbmc<- CellCycleScoring(object = pbmc, g2mfeatures = ccgenes$g2mgenes, sfeatures = ccgenes$sgenes)

head(x = pbmc@metadata)

DimPlot(pbmc,reduction = "tsne",label = TRUE,groupby="Phase",ptsize = 15)

## 存储结果

saveRDS(pbmc, file = "D:/pbmc_tutorialrds")

save(pbmc,file="D:/res05Robj")

## 寻找cluster 1的marker

cluster1markers <- FindMarkers(pbmc, ident1 = 1, minpct = 025)

head(cluster1markers, n = 5)

## 结果:      p_val             avg_logFC        pct1       pct2        p_val_adj

MT-CO1  0000000e+00    -06977083      0985       0996       0000000e+00

RPS27  2182766e-282     03076454       1000       0999        3480202e-278

MT-CO3 2146399e-274    -04866429      0995       0997       3422218e-270

DUSP1  2080878e-247    -17621662       0376       0745       3317752e-243

RPL34  8647733e-244     03367755        1000       0997       1378795e-239

##寻找每一cluster的marker

pbmcmarkers <- FindAllMarkers(pbmc, onlypos = TRUE, minpct = 025, logfcthreshold = 025)

pbmcmarkers %>% group_by(cluster) %>% top_n(n = 2, wt = avg_logFC)

# A tibble: 24 x 7

# Groups:   cluster [12]

       p_val avg_logFC pct1 pct2 p_val_adj cluster gene 

       <dbl>     <dbl> <dbl> <dbl>     <dbl> <fct>   <chr>

 1 229e-123     0636 0344 0097 365e-119 0       CD8B 

 2 762e-113     0487 0632 0305 122e-108 0       LEF1 

 3 204e- 74     0483 0562 0328 325e- 70 1       LEF1 

 4 139e- 61     0462 0598 039  222e- 57 1       ITM2A

 5 0            269  0972 0483 0        2       GNLY 

 6 0            240  0964 0164 0        2       GZMB 

 7 131e-121     0768 0913 0671 209e-117 3       JUNB 

 8 206e- 94     0946 0426 0155 328e- 90 3       RGS1 

 9 205e-255     157  0586 009  327e-251 4       GZMK 

10 294e-140     157  069  0253 468e-136 4       KLRB1

# with 14 more rows

## 存储marker

writetable(pbmcmarkers,file="D:/allmarkertxt")

## 各种绘图

## 绘制Marker 基因的tsne图

FeaturePlot(pbmc, features = c("MS4A1", "GNLY", "CD3E", "CD14", "FCER1A", "FCGR3A", "LYZ", "PPBP", "CD8A"),cols = c("gray", "red"))

## 绘制Marker 基因的小提琴图

VlnPlot(pbmc, features = c("MS4A1", "CD79A"))

VlnPlot(pbmc, features = c("NKG7", "PF4"), slot = "counts", log = TRUE)

## 绘制分cluster的热图

top10 <- pbmcmarkers %>% group_by(cluster) %>% top_n(n = 10, wt = avg_logFC)

DoHeatmap(pbmc, features = top10$gene) + NoLegend()

剩下的便是寻找基因 marker 并对细胞类型进行注释(见下回分解)