单细胞分析方法

在过去的10年里，发展了多种单细胞方法，不同的方法影响了细胞的捕获和扩增，以及每个细胞的read深度等[2]。每种方法都有各自的优缺点，但一般说来，迄今为止发展起来的所有scrna-seq技术都共享一个共同的工作流程：样品制备、单细胞捕获、反转录和扩增、文库制备、测序和分析[3]。

1、样本制备（分离细胞）

单细胞RNA测序的一般实验工作流程始于将感兴趣的器官或组织解离。充分的样本准备是产生良好的单细胞转录组数据的先决条件。样品制备过程中的一个关键步骤，特别是对于致密组织，是单细胞解离，这通常是在温和的机械搅拌(在某些情况下通过组织灌注)下通过酶促实现的，以限制过多的细胞溶解和背景噪音[4]。蛋白水解酶(如胰蛋白酶、胶原酶或解放酶)的选择和消化时间也应仔细优化，以最大限度地提高单细胞产量，同时将细胞死亡降至最低。

2、分离单个细胞

早期的单细胞捕获方法包括显微移液法、显微操作法和激光捕获显微切割法[26-27]。与目前常用的几种方法相比，这些方法通量低，技术上具有挑战性，需要费时费力，但在需要分析的细胞数量较少(如稀有细胞)时仍可使用。

荧光激活细胞分选(FACS)是一种特殊类型的流式细胞术，它提供了一种方法，根据细胞大小和荧光，一次一个细胞地分选不同种类的细胞，与早期的方法相比，它具有更高的通量和更快的速度[29]。流式细胞仪的潜在限制包括需要特定的抗体，以及这些抗体可能干扰下游分析，但也包括所需的大量输入材料(微升甚至毫升)，这阻碍了从极少量样本中分离细胞或分离稀有细胞[29]。

微流控设备的出现使其作为分离细胞的首选技术，因为它们相对于FACS和其他以前使用的方法需要较小体积的试剂。在微流控器件中，流体动力通量允许在几十微米到几百微米的通道中隔离和处理单胞，因此可以与单胞的大小相媲美。此外，微流控设备还可以使一些下游RNA处理反应自动进行测序，并允许测量和控制细胞外试剂浓度[30]。还有另外几种分离技术和平台，具体可看综述[31]。

2、mRNAs捕获

当细胞完全分离时，必须捕获成熟的mRNAs，将其反转录成cDNA并进行扩增。细胞捕获的方法通常由感兴趣样本的属性(如细胞大小)决定。目前的scRNA-seq技术可以根据单细胞分离和捕获的方法进行分类，不同的方法决定了不同的产量、规模、测序深度。细胞捕获的效率取决于所使用的protocol。许多设备使用特定的barcode，它允许同时捕获多个细胞和mRNA，这一过程被称为“‘multiplexing”。例如inDrop和Drop-Seq方法都在液滴中包括了barcode的cDNA制备。

3、逆转录和PCR扩增

通常，使用寡聚脱氧核糖核酸引物进行mRNA的RT。这样做是为了避免捕获其他结构RNA，如核糖体RNA和转运RNA，它们占细胞RNA的大部分。然而寡聚脱氧核糖核酸引物的使用存在捕获效率低的问题，据报道，对于目前的protocols，捕获效率约为10-15% [28]。

4、文库制备

当单细胞被成功捕获后，它们被裂解和加工，通过反转录产生第一链cDNA，然后进行第二链合成和PCR扩增。一些scRNA-seq方法(如Fluidigm C1 system)所需的PCR扩增反应与分析的细胞数量一样多，但是其它技术(诸如基于液滴的方法)允许使用细胞barcoding技术(如10xGenomics Chromium)的混合PCR，降低了成本并提高了产量[5]。

4、测序

5、mapping

执行下一代测序以产生原始数据，当单细胞捕获、文库准备和测序完成后，可以将原始数据进行read比对。最初为bulk RNA-seq开发的mapping工具也适用于scRNA-SEQ数据。有多重mapping工具可以用来比对RNA-seq数据，目前流行的比对工具如TopHat2、STAR和HISat在速度和准确性方面表现良好，它们可以有效地将数十亿read比对到参考基因组或转录组上。其中STAR是一种基于后缀数组（suffix-array based）的方法，比TopHat2更快，但它所需内存较大[22]。 HISAT是基于BWT和Ferragina-Manzini (FM)方法发展起来的。Kim等人的研究表明，HISat是目前最快的工具，并可以达到与其他可用的校准器（ aligners）相等或更高的精度[23]。

可以使用通用的RNA-seq read比对软件STAR生成具有公共可用平台(如10x基因组公司的Cell Ranger)的特征条形码（ feature-barcode）矩阵。也可以使用Cell Ranger来过滤和计数barcode以及UMI。cellranger、dropEst、Drseq2 、scPipe都可以用于生成表达矩阵。

6、转录本定量

不同处理步骤带来的高技术可变性阻碍了准确量化转录本丰度的能力。目前，这些问题的可能解决方案是增加定量标准，如添加Spike-in或唯一分子标识符(UMIS)。

Spike-ins 是一段已知序列和数量的RNA转录本，在细胞裂解液中按一定的量加入，用于校准rna杂交分析的测量在细胞分离后经过所有的实验步骤。使用这些分子的目的是提供关于分子的输入数量和观察到的测序读数数量之间的关系的信息。最受欢迎的一组插入是ERCC的92个单一异构体合成RNA[32]。使用Spike-ins 的一个复杂之处在于，它们通常以较高的相对浓度添加到单细胞样本中，因此，它们占据了相对较大的reads比例。因此，并不是所有的protocols都能适应它们的使用，例如基于液滴的技术 。

在scRNA-seq中使用的另一种类型的定量标准是UMI。它们是长度为4到12个核苷酸的核苷酸序列，它们在逆转录之前被合并到引物中，以唯一地对每个转录本的每个单独mRNA拷贝的5‘或3’端进行barcode。同一种mRNA连上同样的UMI概率几乎为0，则我们可以忽略由于PCR造成的误差，对于一种mRNA，测到的UMI数量可以近似看成mRNA的表达个数。其基本思想是能够根据不同UMI的数量对每个转录本进行量化，从而避免由于PCR扩增而产生的偏差。为了避免低估高表达基因的原始转录本数量，必须选择UMIS的长度n，以便唯一barcode的数量高于在最高水平表达的转录本的数量[28]。基于UMI的协议消除了与扩增和测序深度相关的偏差，因为与同一UMI相关联的、来自同一转录拷贝的多个读数被折叠成唯一的计数。然而，只有当所有的文库都以足够的深度进行测序，以便每个唯一标记的分子至少被观察到一次时，这才是正确的。如果不是，一些UMI标记的cDNA分子可能会丢失[33]。

由于固有的协议差异，Spike-ins和UMIS并不适用于所有的scRNA-seq技术。Spike-ins用于Smart-seq2和Super-seq等方法，但与基于液滴的方法不兼容，而UMIS通常应用于3'端测序技术（如Drop-Seq、InDrop和Mars-Seq）。因此，用户可以根据技术特性和优点、要测序的细胞数量和成本考虑来选择合适的scRNA-seq方法。

对于基因/转录本表达的定量，需要根据scRNA-seq捕获的转录本序列的范围，采用不同的方法。

对于全转录scRNA-seq方法(如Smart-seq2和MATQ-seq)生成的数据可以用为bulk RNA-seq开发的软件进行分析，以定量基因/转录本的表达。

①目前比较流行的基因组组装工具，包括Cufflinks、RSEM、Stringtie等已被广泛用于许多scRNA-seq研究，以获得相对基因/转录本的表达估计。其中Pertea等人[24]指出，StringTie在基因/转录本重建和表达定量方面优于其他工具。

对于3'端scRNA-seq协议(例如CELseq2、MARS-seq、Drop-Seq和InDrop)，需要特定的算法来基于UMIS计算基因/转录本的表达。

①SAVER是一种基于UMI的有效工具，用于精确估计单细胞的基因表达[25]。

为了确保高质量的scRNA-seq数据，在细胞捕获之前适当地将组织解聚成单个细胞是至关重要的。单细胞制备的主要挑战包括起始样品的脆性、物理应力、缓冲液的选择、细胞解离的持续时间和单细胞的产量[18]。对于基于微滴的scRNA-seq，在单细胞捕获之前需要制备活的单细胞群体，并且必须清除细胞聚集体或成团、死亡细胞碎片和自由漂浮的mRNA。传统的细胞分离方法对于单细胞制备就足够了，但是必须优化将原生组织（primary tissue）酶解为单个活细胞的效率，以避免失去比较脆弱或容易死亡的细胞群体。细胞外基质的组成和组织的类型可能会影响消化酶的选择以及消化的温度和持续时间，还应根据原始组织来选择和优化酶解方法[15]。

建议解离后立即用钙黄绿素乙氧甲基等染料标记活细胞，然后用流式细胞仪(FACS)对活细胞进行阳性选择,而一些核酸结合染料，如碘化丙啶等，能与自由漂浮的双链核酸结合，通过流式细胞仪负选择来分离活细胞[4]。在单细胞制备过程中使用商用细胞碎片清除解决方案有助于提高样品清洁度和目标细胞计数的准确性，特别是对于存活率低于70%的细胞制剂[4]。

1、基于液滴（droplet）的方法： 基于液滴的方法使用了DNA条形码技术对包裹在油滴中的单个细胞进行分析，大大减少了每次分析所需的时间和成本。大规模分析使得每个样本可分析多达约10,000个细胞[11]。使得其具有高通量，捕获效率高的特点。并可以提供更大的细胞通量和更低的细胞测序成本。因此，基于液滴的方案适用于产生大量细胞来识别复杂组织或肿瘤样本的细胞亚群。

其中10x Genomics能够实现单细胞的3‘端或5’端测序，与平板或微流控方法相比，具有更高的规模和产量。每个细胞的read深度在10000到100000之间[13]。基于液滴的方法通过3‘端或5’端测序来量化转录本，与现有的其他方法(10-20%)相比，转录本回收率(3-10%)降低了[12]。

细胞检测率和mRNA的捕获效率偏低。在灵敏度和read深度方面表现也有所欠佳，但其灵敏度仍然足以用于复杂异质样品的大规模分析，并有望随着方法的不断优化和成本的降低而提高。

2、plate-based或microwell-based的方法： 如果实验中细胞量不大，可以考虑plate-based的方法，将细胞分选到含有建库PCR引物的多孔板中，捕获细胞的性价比比较低，但检出率较高[1]，另外这些方法既支持3'/5'端测序，也支持全长转录本测序。基于平板或基于微孔板的方案使用自动微吸管或荧光激活细胞分选(FACS)将单个细胞分离到包含裂解缓冲液和其他处理试剂的96孔板或384孔板中。这种方法的一个主要优点是可以在分析前长期保存细胞样本，这为实验计划和协调提供了灵活性。plate-based或microwell-based的方法通常具有很高的灵敏度，并且可以可靠地量化每个细胞多达10,000个基因。然而，这种方法的一个缺点是必须在单独的well中进行逆转录，这可能会减慢工作流程，限制产出，并增加下游分析中的噪音[4]。

3、Microfluidic-based的方法： 基于微流控的自动化平台，在微流控器件中，流体动力通量（hydrodynamic flux）允许在几十微米到几百微米的通道中隔离和处理单个细胞，其通道大小可以与单个细胞的大小相媲美。这种方法的一个关键特点是可以在反转录和扩增之前在显微镜下查看捕获的细胞，此外，该技术所需的小体积细胞悬浮液(<150nL/孔)有助于降低外部污染的风险[6]，并允许测量和控制细胞外试剂浓度。该方法具有较高的灵敏性，使用全长转录本测序可以检测单核苷酸变体和转录起始点的特征以及单等位基因和印记基因等[6]。但是由于每个微流控阵列的单细胞捕获位点数量有限，其在规模和产量方面受到限制(每次仅分析100到1,000个细胞)。

此外，这种方法还需要细胞大小的均匀性，而且比其他技术成本更高，限制了其在高通量实验中的使用。

CEL-SEQ方法[9]，结合了通过体外转录的线性扩增和标记了barcode样本的汇集，以便于并行分析多个样本。

CEL-seq2方法[8]，实现了单一文库的构建，并提高了转录本和基因检测的灵敏度。与可以捕获全长转录本的Smart-seq方法相比，CEL-seq2仅限于3‘端阅读，因此不能检测到替代剪接形式、microRNA或其他非多聚腺苷酸转录本[10]。

1、与基于液滴的方法不同，基于平板或基于微流控的方法可以容纳各种大小和形状的细胞，但受到繁琐和昂贵的单细胞选择和分离的限制[16]。

2、每种scRNA-seq协议都有其优缺点，考虑到研究目的和测序成本之间的平衡，可能需要采用特定的scRNA-seq技术[17]。

3、先前的一项研究表明，通过比较CEL-seq2、MARS-seq、Smart-seq、Drop-seq 在内的scRNA-seq技术，Smart-seq2可以检测到更多的表达基因。

4、盛等人表明[18]，一种全长转录本测序方法MATQ-seq在检测低丰度基因方面可能优于Smart-seq2。

5、不同的scRNA-seq protocols具有不同的优点和缺点，一些发表的评论已经详细比较了其中的一部分[17,19]。

6、几种scRNA-seq技术可以捕获polyA+ 和 polyA− RNAs，例如SUPeR-seq [20]和MATQ-seq [21]。这些protocols对于对长非编码RNA(LncRNAs)和环装RNA(CircRNAs)进行测序非常有用。大量研究表明，lncRNAs和CircRNAs在细胞的多种生物学过程中发挥着重要作用，可能成为癌症的重要生物标志物。因此，这种scRNA-seq方法可以在单细胞水平上全面探索蛋白质编码和非编码RNA的表达动态。

10x Genomics空间转录组测序技术通过将组织切片的高通量mRNA分析和形态学背景整合，使基因表达谱可以被定位回它们的原始空间位置。传统的空间转录组测序技术局限于冰冻组织切片。10x Genomics推出全新的针对FFPE样本的Visium空间基因表达解决方案，该技术打破从FFPE组织样本中获取空间全部转录组基因表达信息的壁垒，能够从FFPE样本中获取高灵敏度、高特异性的相关基因的表达信息，在形态学背景下实现真正的探索发现，进一步扩展空间生物学的可能性。

一、FFPE空间转录组技术原理

为同时获得空间表达和组织学背景信息，该方案首先将FFPE组织切片置于Visium基因芯片上进行组织学染色和成像，然后利用切片下方Visium基因芯片上的探针进行表达定量。由于FFPE样本通常存在RNA高度降解的问题，针对FFPE样本的Visium空间基因表达解决方案无法像新鲜冻存组织样本一样利用完整mRNA具有的poly（dA）序列进行mRNA捕获。该方案采用针对编码基因的成对RNA模板连接探针（RTL）与mRNA杂交。左侧探针（LHS）具有部分Read 2序列，右侧探针（RHS）具有合成的poly(A)序列。左右探针与mRNA杂交后彼此连接，而mRNA被RNase降解。组织透化后，被连接的成对探针与芯片上包含空间Barcode、UMI和poly(dT）序列的引物序列捕获，并且空间Barcode和UMI序列被延伸到成对探针序列上。最后携带空间Barcode的探针序列用于进行测序文库构建和测序。测序序列上的空间Barcode用于将测序序列定位到组织切片图像上，UMI用于基因表达定量。

二、FFPE空间转录组技术优势

1、FFPE组织的Visium基因表达具有高敏感性、特异性和可重复性

对小鼠脑FFPE与新鲜冷冻组织分别进行Visium分析发现，两种组织检测到的基因具有高度相关性，显示了Visium对FFPE样本的可靠性和高灵敏度。例如， Hpca 基因突变导致海马钙结合蛋白缺失，抑制神经元电压门控钙通道，或者影响神经元膜电位的维持，从而影响细胞膜去极化。 Hpca 在新鲜冷冻和FFPE样品的海马体中均有表达，与已知的表达模式一致。此外，小鼠脑FFPE样本连续切片的Visium表现高重现性，表明该技术具有可重复性。

2、FFPE组织的Visium空间基因表达覆盖度广,可全面检测FFPE样本中的基因信息

将针对FFPE样本的Visium基因表达技术应用于一个人乳腺癌样本，检测到大约18,000个基因。H&E染色图像上全部覆盖了空间表达数据。乳腺癌关键基因 ERBB2 、 PGR 和 ESR1 的表达显示明显的空间分布。

**推荐有《湮灭》、《罪恶之家》。

1、《湮灭》

是20184月13日刚上映的一部科幻题材的**，由奥斯卡影后娜塔莉·波特曼领衔主演。五人组成的探索小组不断深入X区域，他们遇到的危险便逐步升级，比如在其中遇到变异的鳄鱼、熊、花草等，而其中的秘密也随之浮现，原来与基因的折射有关系。

在我们的人之外，会存在很多意想不到的事情，像影片中的X区域，当它出现在我们的世界里，我们会感到惊慌失措，因为我们无法掌握未知的东西，它或许会带来不可预测的微信，但是，这也是我们继续探索的原因。

2、《罪恶之家》

亚瑟(肯·斯托特 Ken Stott 饰)是一位成功的资本家，在不久之后即将加官进爵。希拉(克洛伊·皮里 Chloe Pirrie饰)是亚瑟的女儿，这位单纯善良的千金**在家宴中接受了男友杰拉德(凯尔·索列尔 Kyle Soller饰)的求婚，两人喜结连理，亚瑟和妻子对这门亲事显然十分满意。

看你的资料你应该是个大叔GG诶？

什么叫“彻底击破女孩子的心理防线”？

我也是个女孩子，我觉得，GG应该充分发挥自己的特点，最好学着幽默点,在你的Girl Friend需要你的时候即使出现，可以开导她，理解她，关心她，照顾她，对她要比别的女孩子好（好得多才对！），如果你们决定以身相许的话，你一定要给她一个浪漫却又不奢华却充满真心实意的求婚!（譬如说去搞一些野花之类的，那要看她喜欢什么了。。。)

以上就是普遍女孩的理想型

为保护您的使用安全，联通SIM卡采用PIN码和PUK码保护。当PIN码输错3次后，SIM卡会自动上锁，手机提示“SIM卡已锁”。

SIM卡被锁后，需要输入PUK才能解锁，您可登录手机营业厅点击“我的联通”＞“安全中心”＞“我的PUK码”，即可查询PUK码。

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1、PIN码的初始密码是1234，如PUK码连续输错10次，SIM卡将会报废，需要补卡后才能继续使用；

2、手机营业厅的具体功能和操作路径以实际页面为准。

シークレットプリンセス神秘王妃（秘密王妃）

日语&罗马拼音&中文：

きみのつく ためいき ふしぎな魔法みたい

Kimino tsukuta meiki fushigi namahou mitai

为你轻轻叹一口气，就会想起那不可思议的魔法

はじまりを やさしく ねぇ 嗫いて

Hajimari woyasa shiku nee sasayaite

开始请温柔点 呐 小声说吧

迷いの森 光るリンゴ 一口かじれば

Mayoi no mori hikaru ringo hitoku chikajireba

迷途之森里 发亮的苹果 若试著咬一口

ドキドキ止まらなくなる

Dokidoki toma rana kunaru

心跳不已随即无法抑止

ステキ きみのエスコットに

Suteki kimino esuko~to ni

太棒了 成为你的舞伴

どきめくの シークレットプリンセス

Tokimekuno shikuretto purinsesu

心怦怦乱跳的 Secret Princess

ガラスの靴 似合うかしら 大丈夫 踊ろう

Garasu no kutsu niau kashira daijoubu odoro u

玻璃鞋会相衬吗？ 刚刚好，来跳舞吧

なれないそのタキシードも

Narena isono takishi~do mo

只是你那不惯穿的西装也

见とれちゃうシークレットプリンセス

Mito rechau shikuretto purinsesu

一直看痴的Secret Princess

そのハート逃げ出さないように 庭の木につないだ

Sono ha~to nigedasana iyoni niwa no ki nitsu naida

为了不让那颗心逃离 把我围在庭院的树边

0时になるまで 见つめてて あたしだけを

Reijini narumade mitsu metete atashi dakewo

直至午夜之前 都请只注视著我

きみにいう ひとこと 耳まで赤くさせる

Kimini iuhitokoto mimi made akaku saseru

你说的一句话 让我红透耳根

花びらの ねがいは 风と游ぶよ

Hanabira nonegaiha kaze toasobuyo

花瓣的愿望 是跟风游玩哟

人鱼になり 海を泳ぐ 泡になっても

Ninyo ninari umi wo oyogu abukuni nattemo

化身人鱼 在海中畅泳 即使化作泡沫

きみを想い続けたい

Kimiwo omoi tsuduke tai

也渴望一直思念你

恋に生きたマーメイドは

Koini ikita ma~meido wa

因恋爱而生的美人鱼

幸せね シークレットプリンセス

Shiawasene shikuretto purinsesu

真幸福呢 Secret Princess

息つぎさえコントロール できないくらいがいい

Ikitsu gisae kontoro~ru dekina ikuraigai

喘息的控制 也做不到的话更好

理想どうりパーフェクトな

Risou doori pa~fekuto na

如理想般完美的

出逢いなの シークレットプリンセス

Deai nano shikuretto purinsesu

相会下的 Secret Princess

ほんとはずっときみのこと 探してたのかもね

Honto hazutto kimi nokoto sagashi tetano kamone

或许其实是一直在寻找著你呢

0时を过ぎても 忘れない 今夜のこと

Reijiwo sugitemo wasurenai konyanokoto

就算过了午夜 也不会忘掉今晚的一切

ステキ きみのプロポーズに

Suteki kimino puropo~zu ni

太棒了 因你提出的求婚

おどろくの シークレットプリンセス

Odorokuno shikuretto purinsesu

而惊讶的 Secret Princess

誓いのキス 目を闭じたら ほっぺたつねられた（ジリリン！）

Chikai nokisu mewoto jitara hoopeta sunerareta

在誓约之吻时闭上了眼 碰到了脸上的却是〔铃铃铃铃！〕

お目覚めは パジャマ姿で Omeza mehapa jamasu gata de

醒来发现 自己身穿睡衣

にやけてる シークレットプリンセス

Niyaketeru shikuretto purinsesu

而羞愧无比的 Secret Princess

このハート射抜かれたとこで 本日はおあずけ

Kono ha~to i nu kareta tokode honjitsu hao azuke

在这颗心被射中当下的现在 今天先告一段落

明日の梦の中 もう一度 お逢いしましょう

Asu mo yume no naka mou ichido o ai shimasho

让我们在明天的梦里 再一次相会吧

　　kizuna（爱的默契）

　　歌词：爱的默契

　　(第一段)

　　晴空被孤立在黑夜

　　不断被扩大毫无设限

　　不需要 感觉

　　平静又清澈的海面

　　被阳光折射后的意念

　　不轻易 改变

　　张开眼就能看得见

　　不需要参考太多意见

　　相信自己会通过考验

　　记住这一点

　　想要听就能听得见

　　真相需要自己去发现

　　太多杂念 杜绝伤悲

　　感受心中的快乐全神贯注

　　默契让你和我不再感觉孤独

　　没有人能更清楚 我对你有多在乎

　　你的微笑吐露对我的归属

　　命运的牵引用爱碰触

　　奇迹让你和我勇敢面对痛苦

　　无论会有多辛苦 无论有多少冲突

　　默契让友情更加坚固

　　(第二段)

　　孤独和不安的黑影

　　不知不觉在黑影到映

　　我要去 哪里

　　我的心逐渐地平静

　　不闪烁也开始不逃避

　　完全的 放心

　　那双眼泄漏了疲倦

　　走不出那忧郁的世界

　　怀疑是种莫名的火焰

　　无法熄灭

　　什麼时候开始改变 眼泪代表某一种喜悦

　　痛苦伤悲 决定忽略

　　感觉完全的虚无感觉不出

　　默契是你和我唯一爱的出路

　　这是生命的进出 其实早已迷了路

　　你的微笑永远在我的心深处

　　命运的牵引尽是迷雾

　　未来还有多少考验我不清楚

　　默契已根深蒂固

　　心和力相约守护

　　我知道你是我的幸福

　　(第三段)

　　我能看见你的伤悲

　　即使你沉默我也能了解

　　我能感觉你的喜悦

　　这份爱抵得住任何离别

　　相亲相爱相互安慰

　　七个人的心能突破重围

　　无论多恐惧 爱让我们更坚强 更努力

　　感受心中的快乐全神贯注

　　默契让你和我不再感觉孤独

　　没有人能更清楚 我对你有多在乎

　　你的微笑吐露对我的归属

　　命运的牵引用爱碰触

　　奇迹让你和我勇敢面对痛苦

　　无论会有多辛苦 无论有多少冲突

　　默契让友情更加坚固

　　日文：

　　痛（いた）いほど 涙（なみだ）溢（あふ）れる深海（しんかい）の夜（よる）を超（こ）え

　　ガラスの水面（すいめん） 手（て）を伸（の）ばせば 光（ひかり）に届（とど）いた

　　见（み）えるものだけが 闻（き）こえる声（こえ）だけが

　　すべてじゃないことに気付（きづ）いて

　　信（しん）じられるもの ひとつふえた今（いま）なら 强（つよ）くなれるね

　　伤（きず）ついてまた辉（かがや）く 无敌（むけき）のKIZUNA（きずな）感（かん）じてる

　　谁（だれ）かじゃなくて君（きみ）じゃなきゃダメ

　　切（せつ）ないほど求（もと）めてる

　　奇迹（きせき）が重（かさ）なれば 运命（うんめい）に変（か）わるみたいに

　　疑（うたが）いなんて破（やぶ）り舍（す）てよう

　　かたいKIZUNA（きずな）を信（しん）じて

　　不安（ふあん）や孤独（こどく）は

　　自分（じぶん）の弱（よわ）さが生（う）み出（だ）す影（かげ）

　　目（め）をそらさないで向（む）き合（あ）えるよ 逃（に）げたりしないで

　　手（て）に触（ふ）れるものや 感（かん）じる热（ねつ）だけが

　　リアルじゃないことを覚（おぼ）えて

　　「支（ささ）え合（あ）う」という

　　意味（いみ）を知（し）った今（いま）なら 强（つよ）くなれるね

　　かけがえのない仲间（なかま）と 结（むす）んだKIZUNA（きずな）は永远（えいえん）

　　何処（どこ）にいたって届（とど）くメロディー

　　独（ひと）りぼっちじゃないから

　　巡（めぐ）り来（く）る季节（きせつ）が命（いのち）を创（つく）り出（だ）すみたいに

　　ゆっくりだけど育（そだ）ててゆこう

　　深（ふか）いKIZUNA（きずな）を信（しん）じて

　　私（わたし）の痛（いた）みは…私（わたし）たちの苦（くる）しみ

　　私（わたし）の笑颜（えがお）は…私たちの喜（よろこ）び

　　分（わ）かち合（あ）うことと 独（ひと）り乗（の）り越（こ）えること

　　7（なな）つの海 结（むす）ぶKIZUNA信（しん）じて！

　　伤（きず）ついてまた辉（かがや）く 无敌（むけき）のKIZUNA（きずな）感（かん）じてる

　　谁（だれ）かじゃなくて君（きみ）じゃなきゃダメ

　　切（せつ）ないほど求（もと）めてる

　　奇迹（きせき）が重（かさ）なれば 运命（うんめい）に変（か）わるみたいに

　　疑（うたが）いなんて破（やぶ）り舍（す）てよう

　　かたいKIZUNAを信（しん）じて

　　--------------------我是正直的分割线------------------

　　itai hodo namida afureru shinkai no yoruwokoe

　　garasu no suimen tewonobaseba hikarini todoita

　　mierumonodakega kikoeru koedakega

　　subetejyanai kotoni kizuite

　　shinji rarerumono hitotsufueta imanara tsuyoku narerune

　　＊kizutsuitemota kagayaku mukeki no KIZUNA kanjiteru

　　dareka jyanakute kimi jyanakya dame

　　setsunaihodo motometeru

　　kisekiga kasanareba unmeini kawarumitaini

　　utaga inande yaburi suteyou

　　katai KIZUNA wo shinjite

　　fuanya kodokuwa jibun no yowasaga umi dasu kage

　　mewo sorasanaide muki aeruyo nigetarishi naide

　　teni furerumonoya kanjiru netsudakega

　　riaru jyanai kotowo oboete

　　sasaeau toiu imiwo shitta imanara tsuyoku narerune

　　kakegaeno nai kakama to musunda KIZUNA wa eien

　　dokoni itatte todoku merodei-

　　hitori bocchi jyanaikara

　　meguri kuru kisetsu ga inochi wo tsukuri umidasu mitaini

　　yukkuri daredo sodateteyukou

　　fukai KIZUNA wo shinji te

　　watashi no itami wa watashi tachino kurushimi

　　wotashi no egawo wa watashi tachi no yorokobi

　　wakachi aukototo hitori nori koeru koto

　　nanatsu no umi musubu KIZUNA shinji te