2012年护士资格考试试题

A 2011年护士资格考试模拟试题

初级护士资格考试设置“基础知识”、“相关专业知识”、“专业知识”、“专业实践能力”等4个科目。

没有英语考试,更多信息可上医学教育网查看:

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B 2013年护士资格证试题与答案

1。滴虫性 C泡沫状

2。最能反映婴儿营养 C身长

3。肠梗阻 C腹泻

4。骨质疏松 A疼痛

5。卡介苗 A2-3天

7。焦虑性神经症 B惊恐

8。属于青紫型先天（法洛四联症）

9。强迫人格(犹豫不决)

10。胎儿娩出首先（清理呼吸道）

11。风湿性心脏病二尖（B心房颤动）

13使用硫酸镁（E严格控制）

14患者女28（C贫血）

15关于上呼吸道（A保持室内）

168月男婴（D75%）

17肝硬化（A12)

1810岁男孩（D用力）

19关于新生儿（A保管）

20慢性左（C下肢水肿）

23 心肺复舒时-外周静脉

24 患儿男，3岁-青霉素

25 患者女，29岁-硫酸镁

26 患儿女，10个月-加快输液

27 患者女，30岁-母乳喂养

28 患者男，45岁-按压患者

29 患者男，50岁-输液量

30 患者男，80岁-烦躁

3210岁男孩子，+D用力

33健康足月新生儿+E用3%过氧

34患者女，63岁+B手术部位的弹力

35支气管哮喘+B发作性呼吸困难

36患者男，50岁，重症肺炎并发感+C输流量

37患者男48岁 C有利于颅内静脉

38患者男，36岁 C护额里饮食

39患者男，80岁 D烦躁

40新生儿室 C22-24

41患者女，28岁，乏力 c检查是否有贫血41怀疑急性胰腺炎时，首选的检查项目是 C血淀粉酶

42脓性指头炎典型的临床表现是B波动性跳痛

43 患者男19岁车祸致伤 B清除上呼吸道异物，保持呼吸道通畅

44 患者男45岁患有支气管 B需认识到要长期规范治疗哮喘，不得自行停药

45 患者女72岁患帕金森病5年 E将注意力集中于地面

46 新生儿室的室温应保持在 D24摄氏度—26摄氏度

47 患者男32岁，车祸后 A锻炼需贯穿骨折愈合全过程

48 患者男30岁因慢性肾小球 C血压变化

49 患者女66岁高血压病史多年 D知道患者配合进行有效安全防护

50 患者男25岁以胰腺癌收入院 A协助患者抓挠减轻瘙痒

51护士准备按医嘱给患者注射西地兰01mg E05ml

52患者女，63岁，因右下肢静脉曲张行大隐静脉高位结扎术 E包扎后应能及足背动脉搏动

53消化性溃疡患者服用率铝碳酸镁片的正确方法是 D餐前服用

54患者女，60岁，肝硬化10年伴大量腹水 B半卧位，头下加枕

55心包炎患者做出下列哪项表述时 A医院的饭太淡，我自己带了几个咸鸭蛋

56患者男，62岁，支气管肺癌手术后3天 E给予吸痰

57患者女，32岁，因乏力纳差5天 C进行相关检查，若未感染可不做处理

5826岁孕妇，妊娠足月，入院待产 E立即做剖腹产准备

59对尿路感染患者的健康角隅种，错误的是 B长期预防性服用抗生素

60早产儿，生后2天 C胆红素脑病

61患儿男，3个月因多汗，烦燥易惊 D每天要保证1—2小时户外运动

62患者男，58岁，行动不便 D胃镜

63患者女，65岁，患有COPD E快呼吸

64患儿男，5岁，摔倒后左肘关节着地送来急诊 C左上臂畸形

65患者男，62岁，2年前行人工瓣膜置换术 A避免出血

6628岁产妇，2天前经 分娩一女婴 D喂哺后用毛巾和肥皂水清洁 和乳晕

67患者男，62岁，因慢性阻塞性肺疾病合并慢性呼吸衰竭入院治疗 D长期规则服用抗生素

68新生儿女，日龄4天 D无需处理，并告知家长正确认识

69患者女，51岁，主诉月经紊乱半年 B纠正与性激素不足有关的健康问题

70 患者男50岁因前列腺增城症入院 C尽早断粮如跑步等 71 乳腺癌特征性的乳腺 B酒窝征

72 溃疡性结肠炎 A升结肠

73 早期流产最常见的 A胚胎染色体异常

74 患者男68岁被人搀扶步如医院C吸氧测量血压

75 2岁小儿，体验结果示体重10Kg C轻度营养不良

76 护理法洛四联症患儿 A预防形成脑血栓

77 患者女17岁，面部危险三角区D海绵状静脉窦炎

78 支气管哮喘的主要之临床 B发作性呼吸困难伴窒息感

79 阿尔茨海默症五患者的首发 C记忆障碍

80 孕妇，孕30周， A膝胸卧位

81 产妇妊娠39周分娩 D加强宫缩

82 孕妇产前检查时发现胎儿 D孕30周

83风湿性心脏病二尖瓣 B心房颤动

84 患者男68恩岁行胰切除术 C严密观察生命体征报告医生

85 关于肺结核患者 D协助患者健侧卧位，轻拍患者背后 咳嗽

86 胰腺癌的好发 A 胰头

87 流行性腮腺炎 E18天

88 患者男37岁，因 A引流胆汁和减压

89 慢性心功能衰竭患者经保守治疗 E如下我咳嗽发烧，我应当现把剩下的抗生素吃掉然后来复诊

90 我预防风湿性心瓣膜 A长期服用抗风湿药物

91 患者男45岁胸部被撞上 C呼吸

92 患者男40岁因脑外伤住院C降低颅内压

93 患者女68岁有慢性哮喘史 D进行家庭氧疗

94 患者男60岁肝硬化10年 D浅昏迷

95 患者男45岁直肠癌 D常规使用乙醇清洁

96 患者男36岁胃溃疡5年 C胃溃疡的发病机制

97 患者男34岁患支气管扩张症 A在饭后1小时进行

98 可能造成睡眠障碍 E安静环境

99 患者男62岁诊断2型糖尿病 A39mmoi/L

100 健康足月新生儿第2天 E3%过氧化液清洗脐部

101进入第二产程的标志是 A宫口开全

102肺结核的化疗原则不包括 D足量

103患者女，26岁。反复发生皮肤粘膜瘀点 C颅内出血

104自发性气胸的治疗措施中首要的是 E使肺尽早复张

105患者女，42岁，诊断为急性胰腺炎 B低脂低蛋白流质饮食

106慢性胃炎患者腹痛发作时，可以缓解腹痛的护理措施不包括B增加活动量

107护士配合医生进行心包穿刺错作时 B术前准备阿托品

108患者因焦虑入院 A入睡困难

109小儿男，10月龄 常规生长发育检测报告 B12—18个月

110护士查房时观察到某急性胰腺炎患者 A低钙反应

111患者男，20岁，因工程塌方被石板压迫4小时 B挤压伤

112先天性心脏病患儿出院时对家长的健康宣教 B积极参加各种体育活动

113患者男，55岁， 常有搔痒不适 C40摄氏度—45摄氏度

114直肠癌的早期症状是 D排便习惯改变

115患者女，54岁，因近半年来进食吞咽困难就诊 C消瘦

患者男，72岁，1恩个月前因极性脑梗死致左侧肢体偏瘫入院

116社区护士对该患者及家属进行健康教育时 D患肢康训练

117首选的健康教育形式是 D对其进行个别教育

患者男，50岁，因甚至不清、行为异常5天

118患者入院后制定的互利措施不恰当的是 C如有便秘及时用肥皂水

119患者经积极治疗后好转，甚至清醒 C逐步增加蛋白质饮食，以植物蛋白为主

患者女，50岁，一氧化碳中毒2小时入院

120为促进一氧化碳的排出，最佳的措施是 B高压氧舱治疗

121此时护士应将患者安置的 是 E平卧位头偏一侧

患儿男，8岁，双眼浮肿双眼浮肿，尿少3天

122目前患儿最主要的护理问题是 E有皮肤完整性受损的危险

123最常见的并发症是 A感染

124最主要的护理措施是 A绝对卧床休息

患者男，35岁，因失眠，乏力，少语

125评估该患者时首先要注意的问题是 C有无自伤自杀行为

126针对患者首要的心理护理是 E劝阻患者的自杀想法

患者男，70岁，有高血压并史10年

127分诊护士最恰当的处理是 B优先神经外科急诊

128接诊护士在配合医生体检时，不正确的做法是 D头部放置冰袋

题干 新生儿女出生第5天，因全身冰冷

129 最可能的诊断 C新生儿寒冷损伤综合症

130 应首选采取的护理 B复温

题干 患者男41岁体重82Kg，因车祸

131 导致呼吸困难的 C呼吸肌麻痹

132 搬运该患者的方法 E四人搬运，其中三人将患者平脱到木板上，一周固定头颈部

133 在与患者的沟通中，会对患者 A向患者介绍脊髓损伤的手术并发症

题干 患者女25岁，患风湿性心脏

134 现遵医嘱行血培养检查 A第1恩日间隔1h采血，共3次，体温升高时采血

135 入院后心脏彩超检查 C动脉栓塞

2013年5月18号上午第一门护士资格考试答案2013年5月18号上午第一门护士资格考试答案：1——5EBABD6——10DBCCC 11---15CACBA 16---20CABAB 21—25CCDBE26—30CCCBE 31---35DBCBC 36—40BBABC 41—45CDAEC 46—50AACDE51—55ECEED 56---60BBBBE 61---65CDCBC 66—70DEDEA 71—75ADDCB76—80CEADC 81—85EAECC 86—90 ECBBA 91—95DEEEE 96—100EAEAB101—105CBDBA 106—110EACAD 111—115EBEBA 116—120EABBC 121—125ACDCD 126—130EDBBC 131-135DBBAB

1、体温单底栏 选 e胃液引流量

2、在传染区 选 病室

3护理质量标准合格率 选 100%

4新生儿不包括 选 角膜反射

5、对青春期孩子选d 性心理教育

6、不属于中医急d痿症

7、食管癌转移 b淋巴转移

8、急性白血病出血c血小板和量异常

9、破伤风抗毒素c15iu

10、幼儿期指c1岁—3岁

11患男28岁因车祸c家属结果无法接受

12患者女37岁出租车司机a上行感染

13、手术室的室温c22—24度

14患者男29岁外伤昏迷b清除空腔一切细菌

15、结肠的主要功能a吸收水分何盐类

16、甲状腺亢进常见于c激动易怒

17、泌尿系肿瘤a无痛性全程内验血尿

18为婴儿注射b颞浅静脉

19、患者男58岁肥厚性心肌病a角色行为强化

20、患者男39岁近日咳嗽b慢性病容

21下列信息属于客观材料c体温391度

22、某新生儿确诊低钙血症c防止心动过缓保持心率100次

23患者男50岁外伤入院d氧中毒

24关于护士坐姿b上身挺直抬头

25护士为一级护理e诊疗间歇中进行临睡前

26在乡卫生院c72ml

27糖皮质激素治疗c控制炎症抑制免疫反应

28小儿男现体重9kgc12个月

29最容易导致癔症b敏感

30患者男38岁因肺部感染e皮下注射盐酸肾上腺素

31患者男，50岁平常嗜酒最可能的疾病是D急性

32患者男65岁脑梗赛入院正确的方法是B热水外裹毛巾

33支气管肺炎患儿体用体温正常是C5-7天

34拔火罐的适应症是B外感风寒，风寒湿pi

35患者女，34岁。昨晚夜间多梦该项医嘱栏内C用红笔写上未用

36护士遵医嘱抽无回血可能原因是B针刺入过度，穿破对血管壁

37右心功能不全生理基础是B体循环淤血

38患者女，3岁首选的处理方法是A地塞米松雾化吸入

39法洛四联症目的是B减慢心率

40患者男55岁立即采取的措施是C心肺复苏

41患者男79患者存在C爱与归属的需要

61护士为破伤风患者处理C集中焚烧

62引起肛瘘最常见的 D 直肠钢管周围浓重

63护士了解到病房内的一位患者有吸毒史C患者的主治医师

64关于婴儿呼吸系统B婴儿呼吸节律很规整

65患者男,33岁,干咳、胸闷C避免闭气用力

66患者女，28岁，双侧D指导患者多做运动

67慢性肺袁性心脏病的 A左心室肥厚

68门静脉系与腔静脉之间D胃底、食管

69精神分裂证的遗传方式最可能的是E常染色体隐性遗传

70在使用胰岛素过程中A对胰岛素敏感导致血糖降低

71治疗外阴A杀菌

72患者女40岁上午D屈膝

73患者女38岁大面积烧伤D大量体

74一位患者因胆绞痛C校医嘱执行

75患者男50岁。因高热B前额，头顶

76支气管扩张患者C恐惧

77艾滋病防治条例E与其有性关系者

78患者女60岁因A淤血红润期

79患者女36岁长期吸烟D阴经套

81某使用静脉留置针的患者不是导致的原因是E封官的肝，，浓度过大

82患者男，68岁脑出血入院最可能的原因是A正在对患者抢救

83年轻男性患者因车祸不妥的是E运送期间暂时停止输液

84哈U那种女，28岁习惯性流产正确的操作是C选择粗长针头注射

85需避光使用的药物是C硝普钠

8630岁初产妇40周男婴不良后果是E胎盘剥落不全

87患者男67岁，饮食为C高热量、高蛋白、高维生素半流食

88患者女，70岁处理措施是B冷敷

89、地高辛用于作用是B增强心肌收缩力

90某护士在一所二级甲等医院A护士条例

91患者在诊疗活动中D医务人员和医疗机构

92正常情况下，胰夜进如十二指肠E胰蛋白酶元

93患者女，78岁，在全麻下进行C用75%酒精擦洗局部皮肤

94为敌百虫中毒患者进行洗胃时E碳酸氢钠溶液

95患者男，89岁，因腹部隐痛E提供3%碳酸氢钠溶液漱口

96护士甲与护士乙E心理因素

97胃溃疡的好发部位A胃小弯

98高血压病的治疗E 性干咳

99患者男，58岁，冠心病史6年A焦虑

100通过解除紧张情绪缓解的B房型提前收缩

101关于人体器官叙述正确C活体器官的捐献与接收

102最容易发生骨肉瘤转移的 B肺

103献血法规定D地方各级采供血机构

105患者女。50岁初诊为高血压A猪肝

106患儿 4岁，因肺炎入院E对患儿拒绝治疗的行为进行批评

107患者男，65岁，因尿血来诊A愤怒期

108最容易引起听神经损害链霉菌

109患者男，29岁，以脑膜炎入院A潮式呼吸

110肝胆外科病区护士夜班D肝胆外科病区护士

111对血糖在正常范围E二甲双挂

112患者女，34岁，因呕吐腹泻B 您快点去卫生间回来就要输液

113关于输血的叙述错误的是 E输血完毕后及时将输血器、血袋物品进行消毒

114便秘患者应用液体石蜡导致 B润滑臂肠，软化粪便

115青春期女孩第二性征表现不包括 A智齿萌出

116在间隔病区工作护士的下列 E护理结核患者后立即更换口罩

117有机农药中毒患者的尿液气味 A蒜臭味

118治疗厌氧菌感染的急性盆腔B 甲硝挫

119H译成中文的正确 B皮下注射

120每日给药次数 C每日三次

121合适的注射 A胸部

122护士在抢救结束 C6小时内

123患者需要复印 D医学影像

124该患者发热的C稽留热

125为明确诊断D石蜡浊试管

126采集上述 E血培养瓶抗凝试管

127患者男，56岁 D左侧

128 结束后，护士应嘱患者D5~10分钟

129改患者发生了B急性废水肿

130此时，护士应为患者C端坐位

131给氧时，护士 D6~8L

132造成该事件B护士没有升起

133根据对患者照成B一级医疗

134改护士A自主

135该家属的行为B自觉遵守医院

C 2010年护士资格考试模拟试题

人民卫生出版社的四本书应该买，今年考试改革了，和去年比有变化，所以往年的题上网看看就别买书了，有很多网站上都有模拟考试，也可以去看看。

人卫的四本书内容就很多了，再看看教科书，考试前能看完就不错了，重要是看会，把知识点都记住。

D 2012年护士资格考试试题该选哪个出版社的资料好

护士资格考试试题： //blogsinacn/s/blog_961464610100wz10 做一做，看看自己复习的全面不全面。 补充： 护士 执业考试辅导资料： //appleuykpass/store/category/11

E 2012年护士资格考试试题及答案

2012年需要护士答案请加：815882613，环球教育助您一次通过考试！

F 2012年护士资格考试的答案

护士《专业实务》

1属于甲类传染病的是（E鼠疫）

2在申请护士执业注册（ D获得经省级）

3要建立良好护际关系（D遇到冲突）

4腰椎间盘突出（腰3-4）

5心脏复苏首选药物（肾上腺素）

6在胎儿分娩（B下降）

7正常分娩（C活跃期）

8不属于医院（E治疗饮食）

9缓解心脏病（D硝化甘油）

10中医（D心肝脾肺肾）

11下列（E高钾）

12临终患者（C否认期）

13患儿男，5岁（E库欣综合征）

14甲状腺功能（A限制患者）

15中医情志（A怒喜思悲恐）

16护患沟通（B开放性原则）

17属于开放式（D您需要吃点）

18压疮发生的原因（C全身）

19对类风湿性关节（E不引起）

20肺炎患者（B金**）

21给婴儿口服（C冷开水）

22亚急性内膜炎（C7-9）

23以下那种药物（A奥美）

24有关直肠肛管（E一旦）

25引起猩红热（E肺炎）

26利尿剂降低（A减少）

27采集24小时（A早七点-次7点）

28护士办理执业注册（)

29急性蜂窝（C患者）

30患者行局部麻醉（B恐惧）

31下列属于侵犯患者（A末经患）

32临产后（A子宫）

33慢性阻塞性（D肺血）

34正常宫颈（）

35：肺心病的预防(E多睡少动 )

36：最易并发阻塞( B支气管)

37:通过兴奋 （ E沙丁）

38：爆发性流脑病（B鼓励）

39《中华人民共和国宪法（B无偿）

40：慢性肺心病 （ C社会)

41:氧气时流量为（B33%）

42;小儿的自我 （B幼儿期）

43;与婴幼儿智力（ D甲状腺）

44;判断小儿体格（A体重身高 ）

45：目前医学界 （ E脑死忘）

46，心脏正常窦性,（B渎房结）

47对诊断不明的（E易致水）

48在护理实践中（D医嘱有错误）

49护士在工作中（B侵袭）

50水痘皮肤病（B仅限表皮）

51对于需要静脉（D手背静脉）

52下列人员中（E取得执业证书1年）

53尿常规检查时（D随时收集）

54抢救时间的（E家属到达的时间）

55婴儿喂养的（D母乳）

56预防慢性阻塞（E冬季）

57心肺脑复苏（D开放）

58地高幸用于（B增强）

59在护理实践中（A健康）

60肾病综合征（D大量）

61正确测量胃管（A从前发）

62预防，医疗，保健（A身体）

63患者男，50岁（B端坐位）

64患者男，35岁（B冰袋冷）

65患者男，68岁（C向家属）

66护士对抑郁症（B如果）

67患者男，70岁（少尿）

68患者男，得知（C当拒绝）

69患者男，25岁（E建立）

70女婴，4个月（A蛋黄）

71患者男78岁（E帮助）

72患者女40岁（E向患者）

73患儿男10岁（D你想爸爸）

74 13岁女生（B嘱其月经）

75 一车祸患者（C男性26岁）

76 在倾听病人（C不必）

77患者男56岁 （ E停用 ）

78在下列患者中 （A 4床 )

79患者男29岁 （ A无菌 ）

80患者患高血压 （ D避免 ）

81患者女，36岁 ( B减轻 )

82为昏迷患者 （ E吸水管 ）

83艾滋病患者 （ D吸痰 ）

84患者男，52岁 （B酸化 ）

85患者男，50岁（ D边 ）

86一位住院患者 （ C表示 ）

87患者女28岁（C中凹）

88患者男36岁（D稽留）

89某医院的（D4级）

90患者男27岁（C幽门）

91患者男56岁（D豆制品）

92患者男55岁（B立即）

93患者男29岁（A止咳）

94患者男58岁（B加床档）

95患者男22岁（D焦虑）

96患者女，30岁(D前额)

97患者女，31岁（B头低）

98患者男，36岁（B平车）

99患者女，38岁（B告诉）

100患者男，34岁（E给患者止血）

101患者女，22岁（E立即通知）

102患儿男，6岁（E感染性）

103患者男，65岁（B测量）

104一位临终患者（C协议期）

105护士误给某青霉素（A一级）

106某医院预防保健科（E停止接种通知）

107患者女，20岁（C更换）

108某护士轮值夜班（B慎独）

109患者男，71岁（）

110患者男，49岁（E定期）

111患者女，27岁（D控制）

112患者男，38岁（D膝胸）

113患者女，32岁（E30%）

114患儿男2岁（B地西）

115患者女64岁（C健胃）

116患者男60岁（C患者）

117患者男30岁（C主动）

118某护士用下（B8;50）

119患者最有（D便秘）

120最恰当的护理（E可给予）

121护士携物品（E给该患者）

122如果过程中（E继续插管）

123无菌的开启（A48h）

124铺好的无菌（A4h）

125带无菌手套时（A 洗手）

126患者男42岁（A在指定场所）

127该患者经检查确诊为（B根据）

128该患者治疗无效（E就近火化）

129术后引流管（B保持）

130医嘱250ML（B30分钟内）

131注射的剂量（D20U）

132注射前应询问患者（E家属）

133接种中介苗（B三角肌）

134接种乙肝疫苗（B三角肌下ID）

135当护士试图和患者（D态度）

136当患者因沮丧（A制止哭泣）

G 2012年护士资格考试的试题

这种试题要等到明年这个时候才会公布，它不像高考那样考完后会立即发布。

H 2012年执业护士考试试题总分是多少分

你好，护士资格考试2011年刚改革，题量不确定，规定是在120-160之间，题量没有确定，总分也没有确定。2011年是每科都130多道题，2011年护士执业资格考试成绩合格线为专业实务：77分，实践能力：76分。一次考试通过两个科目为考试成绩合格。

提取基因组DNA和细胞核DNA是不同的方法

提取细胞核要先把细胞破碎分离出细胞核，要在甘油或其他保护剂中进行

SDS十二烷基磺酸钠：可破坏细胞膜、核膜，并使组织蛋白与DNA分离

CATB是一种抽提液，破坏细胞膜的~具体忘了~

DNA不溶于异丙醇，异丙醇可以析出DNA，产生白色絮状沉淀，用枪头挑出就可以了

以下是一些具体方法，希望有用

基因组DNA提取方法

制备基因组DNA是进行基因结构和功能研究的重要步骤，通常要求得到的片段的长度不小于100-200kb。在DNA提取过程中应尽量避免使DNA断裂和降解的各种因素，以保证DNA的完整性，为后续的实验打下基础。主要是CTAB方法，其他的方法还有1物理方式:玻璃珠法,超声波法,研磨法,冻融法。2化学方式：异硫氰酸胍法,碱裂解法3生物方式:酶法。根据核酸分离纯化方式的不同有:硅质材料、阴离子交换树脂等

试验步骤：

1、贴壁细胞用胰酶消化，离心收集。

2、细胞重悬于冰冷的PBS漂洗一次，离心收集。试验步骤2再重新作一边。

3、加入5mlDNA提取缓冲液，(10mmol/LTris-cl,01mol/LEDTA,o5%SDS),混匀。

4、加入25ul蛋白酶K,使终浓度达到100ug/ml,混匀，50℃水浴3h,

5、用等体积的酚抽提一次，2500rpm离心收集水相，用等体积的（酚，氯仿，异戊醇）混合物抽提一次，2500r/min离心收集水相

6、用等体积的氯仿，异戊醇抽提一次。加入等体积的5mol/L的LiCL,混匀，冰浴，10min。

7、2500rpm离心10min转上清于一离心管中。加入等体积的异丙醇。室温10min。

2500rpm,离心10min。弃上清。

8、加入01倍体积3mol/L乙酸钠(PH52)与2倍体积-20℃预冷无水乙醇。-20℃20min。

9、12000r/min,室温离心5min。弃上清。将DNA溶于适量TE中。

外周血DNA提取技术

分离外周血白细胞提取方法：

试验步骤：

1、取人肘静脉血5ml，EDTA抗凝，2500rpm离心10min。

2、小心吸取上层血浆，分装到3个05ml离心管中。

3、在血细胞中加入3倍体积的溶血液，摇匀，冰浴15min。

4、2500rpm离心10min，弃上清。

5、加入10ml溶血液，摇匀，冰浴15min。

6、3000rpm离心10min，弃上清。

7、倒置离心管，去掉残液。

8、得白细胞，－80C冻存。

试验要求：

血至分离白细胞之间隔时间在室温下放置不超过2h，4℃放置不超过5h，以防白细胞自溶。

氯仿法抽提外周血白细胞基因组DNA：

试验试剂：

Ligsisbuffer：

133mMNH4ClNHCl712g09mMNH4HCO3NH4HCO30071g01mMEDTA05mMEDTA02ml；最后加灭菌去离子水至1000ml，高压灭菌。

ACD抗凝剂：柠檬酸168g柠檬酸钠462g葡萄糖515g；最后加灭菌去离子水至350ml，高压灭菌。

提取缓冲液（Extractionbuffer）：

10mMTrisCl(PH=80)1MTrisCl(PH=80)1ml01mMEDTA(PH=80)05mMEDTA(PH=80)20ml05%SDS10%SDS05ml；最后加灭菌去离子水至100ml，高压灭菌

试验步骤：

1、在500μl抗凝血中加入ligsisbuffer1000μl，充分颠混至清亮。以4000rpm，离心5min。弃上清液。

2、沉淀中加入ligsisbuffer1500μl，充分匀浆。以6000rpm，离心5min。

3、彻底弃去上清，加入extractionbuffer500μl（裂解细胞），混匀置于37℃，水溶1h。

4、加入8μl的蛋白酶K，颠混，37℃过夜（或55℃，3h，但是37℃效果要好些）。

5、每管加入450μl饱和酚（取溶液下层）缓慢摇晃10min，以5500rpm，离心15min。

6、取上清，每管加入250μl饱和酚和250μl氯仿－异戊醇，摇匀10min，以5500rpm，离心15min。

7、取上清，每管加入500μl氯仿－异戊醇，摇匀10min，以5500rpm，离心15min。

8、取上清，每管加50μl的3M的NaAC＋，适量无水乙醇（预冷）至满，摇匀放入-20℃保存2h以上。

9、以12000rpm，离心20min。去上清，加入70％乙醇500μl，以12000rpm，离心5min，去上清，50－60℃干燥。

10、加入50μl灭菌去离子水，转弹，混匀。

NaI提取法提取外周血白细胞基因组：

实验步骤：

1、取外周抗凝血（全血）100ul于eppendorf管中，12000rpm离心12min。

2、弃上清，加双蒸水200ul溶解，摇匀20s。

3、混匀后加6MNaI溶液200ul，摇匀20s。

4、加入氯仿/异戊醇（24：1）400ul，边加边摇，摇匀20s，12000rpm离心12min。

5、取上层液350ul，加入另一新eppendorf管中，加06倍体积异丙醇，摇匀20s，室温放置15min，静置后的反应体系15000rpm离心12min，使沉淀紧贴eppendorf管壁。

6、弃异丙醇，加70％乙醇1ml（不振动），以15000rpm离心12min。

7、弃乙醇，敞开eppendorf管盖，烘干（37℃恒温箱）后，加1xTE溶液30ul，溶解DNA＞12h以上，制成的DNA液-20℃冰箱保存备用。

常用的外周血白细胞基因提取方法：

试验原理：

苯酚/氯仿提取DNA是利用酚是蛋白质的变性剂，反复抽提，使蛋白质变性，SDS(十二烷基磺酸钠)将细胞膜裂解，在蛋白酶K、EDTA的存在下消化蛋白质或多肽或小肽分子，核蛋白变性降解，使DNA从核蛋白中游离出来。DNA易溶于水，不溶于有机溶剂。蛋白质分子表面带有亲水基团，也容易进行水合作用，并在表面形成一层水化层，使蛋白质分子能顺利地进入到水溶液中形成稳定的胶体溶液。当有机溶液存在时，蛋白质的这种胶体稳定性遭到破坏，变性沉淀。离心后有机溶剂在试管底层(有机相)，DNA存在于上层水相中，蛋白质则沉淀于两相之间。酚-氯仿抽提的作用是除去未消化的蛋白质。氯仿的作用是有助于水相与有机相分离和除去DNA溶液中的酚。抽提后的DNA溶液用2倍体积的无水乙醇在1/103mol/LNaCl存在下沉淀DNA，回收DNA用70%乙醇洗去DNA沉淀中的盐，真空干燥，用TE缓冲液溶解DNA备用。

试验步骤：

1、将1mlEDTA抗凝贮冻血液于室温解冻后移入5ml离心管中，加入1ml磷酸缓冲盐溶液（PBS），混匀，3500rpm离心15min,倾去含裂解红细胞的上清。重复一次。用07mlDNA提取液混悬白细胞沉淀，37℃水浴温育1h。

2、将上述DNA提取液混悬白细胞，37℃水浴温育1h后，加入1mg/ml蛋白酶K02ml,至终浓度为100-200ug/ml,上下转动混匀，液体变粘稠。50℃水浴保温3h，裂解细胞，消化蛋白。保温过程中，应不时上下转动几次，混匀反应液。

3、反应液冷却至室温后，加入等体积的饱和酚溶液，温和地上下转动离心管5-10min，直至水相与酚相混匀成乳状液。5000rpm离心15min，用大口吸管小心吸取上层粘稠水相，移至另一离心管中。重复酚抽提一次。加等体积的氯仿：异戊醇（24：1），上下转动混匀，5000rpm离心15min，用大口吸管小心吸取上层粘稠水相，移至另一离心管中。重复一次。

4、加入1/5体积的3mol/LNaAc及2倍体积的预冷的无水乙醇，室温下慢慢摇动离心管，即有乳白色云絮状DNA出现。用玻璃棒小心挑取云絮状的DNA，转入另一15ml离心管中，加70%乙醇02ml，以5000rpm离心5min。洗涤DNA，弃上清，去除残留的盐。重复一次。室温挥发残留的乙醇，但不要让DNA完全干燥。加TE液20ul溶解DNA,置于摇床平台缓慢摇动，DNA完全溶解通常需12-24h。制成的DNA液-20℃冰箱保存备用。

真核细胞DNA的制备

一般真核细胞基因组DNA有107-9bp，可以从新鲜组织、培养细胞或低温保存的组织细胞中提取，常是采用在EDTA以及SDS等试剂存在下用蛋白酶K消化细胞，随后用酚抽提而实现的。这一方法获得的DNA不仅经酶切后可用于Southern分析，还可用于PCR的模板、文库构建等实验。

根据材料来源不同，采取不同的材料处理方法，而后的DNA提取方法大体类似，但都应考虑以下两个原则：

1、防止和抑制DNase对DNA的降解。

2、尽量减少对溶液中DNA的机械剪切破坏。

试剂准备：

1、TE:10mMTris-HCl(pH78);1mMEDTA(pH80)。

2、TBS:25mMTris-HCl(pH74);200mMNaCl;5mMKCl。

3、裂解缓冲液：250mMSDS;使用前加入蛋白酶K至100mg/ml。

4、20%SDS

5、2mg/ml蛋白酶K

6、Tris饱和酚（pH80）、酚/氯仿（酚∶氯仿=1∶1）、氯仿

7、无水乙醇、75%乙醇

试验步骤：

材料处理：

1、新鲜或冰冻组织处理：

1)取组织块03-05cm3,剪碎，加TE05ml，转移到匀浆器中匀浆。

2)将匀浆液转移到15ml离心管中。

3)加20%SDS25ml，蛋白酶K(2mg/ml)25ml，混匀。

4)60°C水浴1-3hr。

2、培养细胞处理：

1)将培养细胞悬浮后，用TBS洗涤一次。

2)离心4000g×5min，去除上清液。

3)加10倍体积的裂解缓冲液。

4)50-55°C水浴1-2hr。

DNA提取：

1、加等体积饱和酚至上述样品处理液中，温和、充分混匀3min。

2、离心5000g×10min，取上层水相到另一15ml离心管中。

3、加等体积饱和酚，混匀，离心5000g×10min，取上层水相到另一管中。

4、加等体积酚/氯仿，轻轻混匀，离心5000g×10min，取上层水相到另一管中。如水相仍不澄清，可重复此步骤数次。

5、加等体积氯仿，轻轻混匀，离心5000g×10min，取上层水相到另一管中。

6、加1/10体积的3M醋酸钠（pH52）和25倍体积的无水乙醇，轻轻倒置混匀。

7、待絮状物出现后，离心5000g×5min，弃上清液。

8、沉淀用75%乙醇洗涤，离心5000g×3min，弃上清液。

9、室温下挥发乙醇，待沉淀将近透明后加50-100mlTE溶解过夜。

植物组织中DNA的提取

试验原理：

脱氧核糖核酸（deoxribonucleicacid，DNA）是一切生物细胞的重要组成成分，主要存在于细胞核中，盐溶法是提取DNA的常规技术之一。从细胞中分离得到的DNA是与蛋白质结合的DNA，其中还含有大量RNA，即核糖核蛋白。如何有效地将这两种核蛋白分开是技术的关键。DNA不溶于014mol/L的NaCl溶液中，而RNA则能溶于014mol/L的NaCl溶液之中，利用这一性质就可以将二者从破碎细胞浆液中分开。制备过程中，细胞破碎的同时就有Dnase释放到提取液中，使DNA因被降解而影响得率，在提取缓冲液中加入适量的柠檬酸盐和EDTA，既可抑制酶的活性又可使蛋白质变性而与核酸分离，再加入阴离子去垢剂015％的SDS，经过2h搅拌，或用氯仿－异醇除去蛋白，通过离心使蛋白质沉淀而除去，得到的是含有核酸的上清液。然后用95％的预冷乙醇即可把DNA从除去蛋白质的提取液中沉淀出来。

植物DNA的SDS提取法：

试验试剂：

1、研磨缓冲液：称取5963gNaCl，1325g柠檬酸三钠，372gEDTA－Na分别溶解后合并为一，用02mol/L的NaOH调至pH70，并定容至1000ml。

2、10×SSC溶液：称取8766gNaCl和4412g柠檬酸三钠，分别溶解，一起定容至1000ml。

3、1×SSC溶液：用10×SSC溶液稀释10倍。

4、01×SSC溶液：用1×SSC溶液稀释10倍。

5、Rnase溶液：用014mol/LNaCl溶液配制成25mg/ml的酶液，用1mol/LHCl，pH至50，使用前经80℃水浴处理5min（以破坏可能存在的Dnase）。

6、氯仿－异戊醇：按24ml氯仿和1ml异戊醇混合。

7、5mol/L高氯酸钠溶液：称取NaClO4．H2O7023g，先加入少量蒸馏水溶解再容至100ml。

8、SDS（十二烷基硫酸钠）化学试剂的重结晶：将SDS放入无水酒精中达到饱和为止，然后在70～80℃的水浴中溶解，趁热过滤，冷却之后即将滤液放入冰箱，待结晶出现再置室温下凉干待用。

9、1mol／LHCl。

10、02mol/LNaOH。

11、二苯胺乙醛试剂：15g二苯胺溶于100ml冰醋酸中，添加15ml浓硫酸，装入棕色瓶，贮存暗处，使用时加01ml乙醛液〔浓乙醛：H2O＝1：50（V／V）〕。

12、10mol/L高酸溶液（HClO4）。

13、005mol/LNaOH。

14、DNA标准液：取标准DNA25mg溶于少量005molL-1NaOH中，再用005mol/LNaOH定容至25ml，后用移溶管吸取此液5ml至50ml容量瓶中，加50ml1mol/LHClO4，混合冷却后用05mol/LHClO4定容至刻度，则得100μg/ml的标准溶液。

实验步骤：

1、称取植物幼嫩组织10g剪碎置研钵中，加10ml预冷研磨缓冲液并加入01g左右的SDS，置冰浴上研磨成糊状。

2、将匀浆无损转入25ml刻度试管中加入等体积的氯仿－异戊醇混合液，加上塞子，剧烈振荡30s，转入离心管，静置片刻以脱除组织蛋白质。以4000rpm离心5min。

3、离心形成三层，小心地吸取上层清液至刻度试管中，弃去中间层的细胞碎片、变性蛋白质及下层的氯仿。

4、将试管置72℃水浴中保温3min（不超过4min），以灭活组织的DNA酶，然后迅速取出试管置冰水浴中冷却到室温，加5mol/L高氯酸钠溶液〔提取液：高氯酸钠溶液＝4：1（V／V）〕，使溶液中高氯酸钠的最终浓度为1mol/L。

5、再次加入等体积氯仿－异戊醇混合液至大试管中，振荡1min，静置后在室温下离心（4000rpm）5min，取上清液置小烧杯中。

6、用滴管吸95％的预冷乙醇，慢慢地加入烧杯中上清液的表面上，直至乙醇的体积为上清液的两倍，用玻璃棒轻轻搅动。此时核酸迅速以纤维状沉淀缠绕在玻璃棒上。

7、然后加入05ml左右的10×SSC，使最终浓度为1×SSC。

8、重复第6步骤和第7步骤即得到DNA的粗制品。

9、加入已处理的Rnase溶液，使其最后的作用浓度为50～70μg/ml，并在37℃水浴中保温30min，以除去RNA。

10、加入等体积的氯仿－异戊醇混合液，在三角瓶中振荡1min，再除去残留蛋白质及所加Rnase蛋白，室温下以4000rpm离心5min，收集上层水溶液。

11、再按6、7步骤处理即可得到纯化的DNA液。

植物DNA的CTAB提取法：

试验步骤：

1、称取新鲜叶片2-3g，剪碎放入研钵中，在液氮中研磨成粉末。

2、将粉末转移到加有7ml经预热的15×CTAB提取缓冲液15ml离心管中，迅速混匀后置于65℃水浴中，温育30min。

3、取出离心管,冷却至室温，加入氯仿/异戊醇(24:1)，充分混匀，室温下2300转离心20min。

4、将上清转移至另一新的15ml离心管中，加入1/10体积10%的CTAB和等体积的氯仿/异戊醇。充分混匀，2300rpm离心20min。

5、转移上清至另一新的15ml离心管中，加入等体积1%的CTAB沉淀缓冲液，轻轻摇晃至形成DNA絮状沉淀。1000rpm离心10min，使DNA沉淀于管底。

6、加入15-2ml的1mol/LNaCl及5μlRNase置于56℃水浴中过夜。

7、待DNA完全溶解后，加2-3ml4℃预冷的95%的冰乙醇使DNA沉淀，挑出DNA，置于15ml离心管中，用70%乙醇清洗30min。

8、离心机甩5s，倒出70%乙醇，再用95%乙醇浸泡5min，倒出95%乙醇，在超净工作台上吹干。

9、将风干的DNA直接在4℃保存备用或溶于100μlTE溶液中于-20℃保存。

细菌DNA的提取方法

针对一些不易于提取的细菌的方法:

试验试剂：

抽提缓冲液：2%CTAB(W/V)2%PVPK25(w/v)（去色素）100mMTris-HCl(pH80)

25mMEDTA(pH80)20MNaCl

10MLiCl

2MLiCl

DEPC-water（抑制RNA酶活性）

3MNaAc(pH52)

96%乙醇

70%乙醇

试验步骤：

1、抽提缓冲液65℃预热。

2、加菌体到已经预热的缓冲液（700ul）中混匀，65℃，10min。

3、加酚/氯仿/异戊醇（25：24：1），振荡，以12,000rpm，离心10min。

4、取上清，加氯仿/异戊醇（24：1）振荡，以12,000rpm，离心10min。

5、重复再作一次步骤4。

6、加入1/10体积的3M醋酸钠和15倍体积的乙醇（或加入等体积的异丙醇），－20C下沉淀。

7、以2,000rpm，离心10min。

8、弃上清，以70％乙醇条洗沉淀，也可以再用100％乙醇洗，然后溶解于100ml水中。

较为常用的细菌DNA提取方法：

实验步骤：

1、将菌株接种于液体LB培养基，37℃震荡培养过夜。

2、取15ml培养物12000rpm离心2min。

3、沉淀中加入567ul的TE缓冲液，反复吹打使之重新悬浮，加入30ul10%SDS和15ul的蛋白酶K，混匀，于37℃温育1h

4、加入100ul5mol/LNaCl,充分混匀，再加入80ulCTAB/NaCl溶液，混匀后再65℃温育10min。

5、加入等体积的酚/氯仿/异戊醇混匀，离心4-5min,将上清转入一只新管中，加入06-08倍体积的异丙醇，轻轻混合直到DNA沉淀下来，沉淀可稍加离心。

6、沉淀用1ml的70%乙醇洗涤后，离心弃乙醇．

真菌DNA提取总结的两种方法：

第一种方法：

试验步骤：

1、取真菌菌丝05g,在液氮中迅速研磨成粉。

2、加入4mL提取液，快速振荡混匀。

3、加入等体积的4mL的氯仿:异戊醇(24:1)，涡旋3～5min（此处是粗提没有加酚）。

4、以4℃，1000rpm，离心5min。

5、上清再用等体积的氯仿:异戊醇(24:1)抽提一次。以4℃，10,000rpm，离心5min。

6、取上清，加入2/3倍体积的-20℃预冷的异丙醇或25倍体积的无水乙醇沉淀,混匀,静置约30min。

7、用毛细玻棒挑出絮状沉淀,用75%乙醇反复漂洗数次,再用无水乙醇漂洗1次,吹干，重悬于500ulTE中。

8、加入1ulRNaseA（10mg/mL），37℃下处理1h。

9、用酚（pH80）:氯仿:异戊醇(25:24:1)和氯仿:异戊醇(24:1)各抽提1次。以4℃，10,000rpm，离心5min。

10、取上清，加入1/10倍体积的3MNaAc,25倍体积的无水乙醇,-70℃沉淀30min以上。

11、沉淀用75%乙醇漂洗，风干,溶于200ulTE中，-20℃保存备用。

DNA提取液：02MTris-HCl（pH75），05MNaCl，001MEDTA，1％SDS，3MNaAc。

第二种方法：

试验步骤：

1、真菌菌丝05-1g,在液氮中迅速研磨成粉。

2、加入3mL65℃预热的DNA提取缓冲液，快速振荡混匀65℃水浴30min,期间混匀2-3次。

3、加入1mL5MKAc，冰浴20min。

4、等体积的氯仿:异戊醇(24:1)抽提1次（10,000rpm，4℃离心5min）。

5、取上清，加入2/3倍体积的-20℃预冷异丙醇,混匀,静置约30min。

6、用毛细玻棒挑出絮状沉淀,用75%乙醇反复漂洗数次,再用无水乙醇漂洗1次,吹干，重悬于500ulTE中。

7、加入1ulRNaseA（10mg/mL），37℃处理1h。

8、用酚（pH80）:氯仿:异戊醇(25:24:1)和氯仿:异戊醇(24:1)各抽提1次。以4℃，10,000rpm，离心5min。

9、取上清，1/10V3MNaAc,25V体积的无水乙醇,-70℃沉淀30min以上。

10、沉淀用75%乙醇漂洗，风干,溶于200ulTE中，-20℃保存备用。

植物基因组提取(CATB法)

作者： 时间：2008-05-13 14:26:27 来源: 生物谷 浏览评论

一、实验目的

掌握植物总DNA的抽提方法和基本原理。学习根据不同的植物和实验要求设计和改良植物总DNA抽提方法。

二、实验原理

通常采用机械研磨的方法破碎植物的组织和细胞，由于植物细胞匀浆含有多种酶类(尤其是氧化酶类)对DNA的抽提产生不利的影响，在抽提缓冲液中需加入抗氧化剂或强还原剂(如巯基乙醇)以降低这些酶类的活性。在液氮中研磨，材料易于破碎，并减少研磨过程中各种酶类的作用。

十二烷基肌酸钠(sarkosyl)、十六烷基三甲基溴化铵(hexadyltrimethyl ammomum bromide，简称为CTAB)、十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate，简称SDS)等离子型表面活性剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使DNA得以游离出来。再加入苯酚和氯仿等有机溶剂，能使蛋白质变性，并使抽提液分相，因核酸(DNA、RNA)水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。上清液中加入无水乙醇使DNA沉淀，沉淀DNA溶于TE溶液中，即得植物总DNA溶液。

三、实验材料

水稻幼叶

四、主要配方

2% CTAB抽提缓冲溶液: CTAB 4g NaCl 16364 g 1M Tris-HCl 20ml( PH80) 05M EDTA 8ml，先用70ml ddH2O溶解, 再定容至200ml灭菌, 冷却后02-1% 2-巯基乙醇 （400ul） 氯仿-异戊醇（24：1）：先加96ml氯仿，再加4ml异戊醇，摇匀即可。

五、实验步骤

1 DNA的提取

（1） 2%CTAB抽提缓冲液在65℃水浴中预热。

（2）取少量叶片（约1g）置于研钵中，用液氮磨至粉状；

（3） 加入700ul的2%CTAB抽提缓冲液，轻轻搅动；

（4） 将磨碎液分倒入15 ml的灭菌中，磨碎液的高度约占管的三分之二；

（5）置于65℃的水浴槽或恒温箱中，每隔10 min轻轻摇动，40 min后取出；

（6）冷却2 min后，加入氯仿-异戊醇（24：1）至满管，剧烈振荡2~3 min，使两者混合均匀；

（7）放入离心机中10 000 rpm离心10 min，与此同时，将600 µl的异丙醇加入另一新的灭菌中；

（8） 10 000 rpm离心1 min后，移液器轻轻地吸取上清夜，转入含有异丙醇的内，将离心管慢慢上下摇动30 sec，使异丙醇与水层充分混合至能见到DNA絮状物；

（9）10000 rpm离心1 min后，立即倒掉液体，注意勿将白色DNA沉淀倒出，将离心管倒立于铺开的纸巾上； （10）60 sec后，直立离心管，加入720 µl的75%乙醇及80 µl 5 M的醋酸钠，轻轻转动，用手指弹管尖，使沉淀与管底的DNA块状物浮游于液体中；

（11）放置30 min，使DNA块状物的不纯物溶解；

（12）10000 rpm离心1 min后，倒掉液体，再加入800 µl 75%的乙醇，将DNA再洗 30 min；

（13）10000 rpm离心30 sec后，立即倒掉液体，将离心管倒立于铺开的纸巾上；数分钟后，直立离心管，干燥DNA（自然风干或用风筒吹干）；

（14）加入50 µl 05 × TE(含RNase)缓冲液，使DNA溶解，置于37℃恒温箱约15 h，使RNA消解；

（15）置于-20℃保存、备用。

2 DNA质量检测

琼脂糖电泳检测，原理和方法见实验二。

六、 注意事项

（1）叶片磨得越细越好。

（2）移液器的使用。

（3）由于植物细胞中含有大量的DNA酶，因此，除在抽提液中加入EDTA抑制酶的活性外，第一步的操作应迅速，以免组织解冻，导致细胞裂解，释放出DNA酶，使DNA降解。

提取基因组DNA和细胞核DNA是不同的方法

提取细胞核要先把细胞破碎分离出细胞核，要在甘油或其他保护剂中进行

SDS十二烷基磺酸钠：可破坏细胞膜、核膜，并使组织蛋白与DNA分离

CATB是一种抽提液，破坏细胞膜的~具体忘了~

DNA不溶于异丙醇，异丙醇可以析出DNA，产生白色絮状沉淀，用枪头挑出就可以了

以下是一些具体方法，希望有用

基因组DNA提取方法

制备基因组DNA是进行基因结构和功能研究的重要步骤，通常要求得到的片段的长度不小于100-200kb。在DNA提取过程中应尽量避免使DNA断裂和降解的各种因素，以保证DNA的完整性，为后续的实验打下基础。主要是CTAB方法，其他的方法还有1物理方式:玻璃珠法,超声波法,研磨法,冻融法。2化学方式：异硫氰酸胍法,碱裂解法3生物方式:酶法。根据核酸分离纯化方式的不同有:硅质材料、阴离子交换树脂等

试验步骤：

1、贴壁细胞用胰酶消化，离心收集。

2、细胞重悬于冰冷的PBS漂洗一次，离心收集。试验步骤2再重新作一边。

3、加入5mlDNA提取缓冲液，(10mmol/LTris-cl,01mol/LEDTA,o5%SDS),混匀。

4、加入25ul蛋白酶K,使终浓度达到100ug/ml,混匀，50℃水浴3h,

5、用等体积的酚抽提一次，2500rpm离心收集水相，用等体积的（酚，氯仿，异戊醇）混合物抽提一次，2500r/min离心收集水相

6、用等体积的氯仿，异戊醇抽提一次。加入等体积的5mol/L的LiCL,混匀，冰浴，10min。

7、2500rpm离心10min转上清于一离心管中。加入等体积的异丙醇。室温10min。

2500rpm,离心10min。弃上清。

8、加入01倍体积3mol/L乙酸钠(PH52)与2倍体积-20℃预冷无水乙醇。-20℃20min。

9、12000r/min,室温离心5min。弃上清。将DNA溶于适量TE中。

外周血DNA提取技术

分离外周血白细胞提取方法：

试验步骤：

1、取人肘静脉血5ml，EDTA抗凝，2500rpm离心10min。

2、小心吸取上层血浆，分装到3个05ml离心管中。

3、在血细胞中加入3倍体积的溶血液，摇匀，冰浴15min。

4、2500rpm离心10min，弃上清。

5、加入10ml溶血液，摇匀，冰浴15min。

6、3000rpm离心10min，弃上清。

7、倒置离心管，去掉残液。

8、得白细胞，－80C冻存。

试验要求：

血至分离白细胞之间隔时间在室温下放置不超过2h，4℃放置不超过5h，以防白细胞自溶。

氯仿法抽提外周血白细胞基因组DNA：

试验试剂：

Ligsisbuffer：

133mMNH4ClNHCl712g09mMNH4HCO3NH4HCO30071g01mMEDTA05mMEDTA02ml；最后加灭菌去离子水至1000ml，高压灭菌。

ACD抗凝剂：柠檬酸168g柠檬酸钠462g葡萄糖515g；最后加灭菌去离子水至350ml，高压灭菌。

提取缓冲液（Extractionbuffer）：

10mMTrisCl(PH=80)1MTrisCl(PH=80)1ml01mMEDTA(PH=80)05mMEDTA(PH=80)20ml05%SDS10%SDS05ml；最后加灭菌去离子水至100ml，高压灭菌

试验步骤：

1、在500μl抗凝血中加入ligsisbuffer1000μl，充分颠混至清亮。以4000rpm，离心5min。弃上清液。

2、沉淀中加入ligsisbuffer1500μl，充分匀浆。以6000rpm，离心5min。

3、彻底弃去上清，加入extractionbuffer500μl（裂解细胞），混匀置于37℃，水溶1h。

4、加入8μl的蛋白酶K，颠混，37℃过夜（或55℃，3h，但是37℃效果要好些）。

5、每管加入450μl饱和酚（取溶液下层）缓慢摇晃10min，以5500rpm，离心15min。

6、取上清，每管加入250μl饱和酚和250μl氯仿－异戊醇，摇匀10min，以5500rpm，离心15min。

7、取上清，每管加入500μl氯仿－异戊醇，摇匀10min，以5500rpm，离心15min。

8、取上清，每管加50μl的3M的NaAC＋，适量无水乙醇（预冷）至满，摇匀放入-20℃保存2h以上。

9、以12000rpm，离心20min。去上清，加入70％乙醇500μl，以12000rpm，离心5min，去上清，50－60℃干燥。

10、加入50μl灭菌去离子水，转弹，混匀。

NaI提取法提取外周血白细胞基因组：

实验步骤：

1、取外周抗凝血（全血）100ul于eppendorf管中，12000rpm离心12min。

2、弃上清，加双蒸水200ul溶解，摇匀20s。

3、混匀后加6MNaI溶液200ul，摇匀20s。

4、加入氯仿/异戊醇（24：1）400ul，边加边摇，摇匀20s，12000rpm离心12min。

5、取上层液350ul，加入另一新eppendorf管中，加06倍体积异丙醇，摇匀20s，室温放置15min，静置后的反应体系15000rpm离心12min，使沉淀紧贴eppendorf管壁。

6、弃异丙醇，加70％乙醇1ml（不振动），以15000rpm离心12min。

7、弃乙醇，敞开eppendorf管盖，烘干（37℃恒温箱）后，加1xTE溶液30ul，溶解DNA＞12h以上，制成的DNA液-20℃冰箱保存备用。

常用的外周血白细胞基因提取方法：

试验原理：

苯酚/氯仿提取DNA是利用酚是蛋白质的变性剂，反复抽提，使蛋白质变性，SDS(十二烷基磺酸钠)将细胞膜裂解，在蛋白酶K、EDTA的存在下消化蛋白质或多肽或小肽分子，核蛋白变性降解，使DNA从核蛋白中游离出来。DNA易溶于水，不溶于有机溶剂。蛋白质分子表面带有亲水基团，也容易进行水合作用，并在表面形成一层水化层，使蛋白质分子能顺利地进入到水溶液中形成稳定的胶体溶液。当有机溶液存在时，蛋白质的这种胶体稳定性遭到破坏，变性沉淀。离心后有机溶剂在试管底层(有机相)，DNA存在于上层水相中，蛋白质则沉淀于两相之间。酚-氯仿抽提的作用是除去未消化的蛋白质。氯仿的作用是有助于水相与有机相分离和除去DNA溶液中的酚。抽提后的DNA溶液用2倍体积的无水乙醇在1/103mol/LNaCl存在下沉淀DNA，回收DNA用70%乙醇洗去DNA沉淀中的盐，真空干燥，用TE缓冲液溶解DNA备用。

试验步骤：

1、将1mlEDTA抗凝贮冻血液于室温解冻后移入5ml离心管中，加入1ml磷酸缓冲盐溶液（PBS），混匀，3500rpm离心15min,倾去含裂解红细胞的上清。重复一次。用07mlDNA提取液混悬白细胞沉淀，37℃水浴温育1h。

2、将上述DNA提取液混悬白细胞，37℃水浴温育1h后，加入1mg/ml蛋白酶K02ml,至终浓度为100-200ug/ml,上下转动混匀，液体变粘稠。50℃水浴保温3h，裂解细胞，消化蛋白。保温过程中，应不时上下转动几次，混匀反应液。

3、反应液冷却至室温后，加入等体积的饱和酚溶液，温和地上下转动离心管5-10min，直至水相与酚相混匀成乳状液。5000rpm离心15min，用大口吸管小心吸取上层粘稠水相，移至另一离心管中。重复酚抽提一次。加等体积的氯仿：异戊醇（24：1），上下转动混匀，5000rpm离心15min，用大口吸管小心吸取上层粘稠水相，移至另一离心管中。重复一次。

4、加入1/5体积的3mol/LNaAc及2倍体积的预冷的无水乙醇，室温下慢慢摇动离心管，即有乳白色云絮状DNA出现。用玻璃棒小心挑取云絮状的DNA，转入另一15ml离心管中，加70%乙醇02ml，以5000rpm离心5min。洗涤DNA，弃上清，去除残留的盐。重复一次。室温挥发残留的乙醇，但不要让DNA完全干燥。加TE液20ul溶解DNA,置于摇床平台缓慢摇动，DNA完全溶解通常需12-24h。制成的DNA液-20℃冰箱保存备用。

真核细胞DNA的制备

一般真核细胞基因组DNA有107-9bp，可以从新鲜组织、培养细胞或低温保存的组织细胞中提取，常是采用在EDTA以及SDS等试剂存在下用蛋白酶K消化细胞，随后用酚抽提而实现的。这一方法获得的DNA不仅经酶切后可用于Southern分析，还可用于PCR的模板、文库构建等实验。

根据材料来源不同，采取不同的材料处理方法，而后的DNA提取方法大体类似，但都应考虑以下两个原则：

1、防止和抑制DNase对DNA的降解。

2、尽量减少对溶液中DNA的机械剪切破坏。

试剂准备：

1、TE:10mMTris-HCl(pH78);1mMEDTA(pH80)。

2、TBS:25mMTris-HCl(pH74);200mMNaCl;5mMKCl。

3、裂解缓冲液：250mMSDS;使用前加入蛋白酶K至100mg/ml。

4、20%SDS

5、2mg/ml蛋白酶K

6、Tris饱和酚（pH80）、酚/氯仿（酚∶氯仿=1∶1）、氯仿

7、无水乙醇、75%乙醇

试验步骤：

材料处理：

1、新鲜或冰冻组织处理：

1)取组织块03-05cm3,剪碎，加TE05ml，转移到匀浆器中匀浆。

2)将匀浆液转移到15ml离心管中。

3)加20%SDS25ml，蛋白酶K(2mg/ml)25ml，混匀。

4)60°C水浴1-3hr。

2、培养细胞处理：

1)将培养细胞悬浮后，用TBS洗涤一次。

2)离心4000g×5min，去除上清液。

3)加10倍体积的裂解缓冲液。

4)50-55°C水浴1-2hr。

DNA提取：

1、加等体积饱和酚至上述样品处理液中，温和、充分混匀3min。

2、离心5000g×10min，取上层水相到另一15ml离心管中。

3、加等体积饱和酚，混匀，离心5000g×10min，取上层水相到另一管中。

4、加等体积酚/氯仿，轻轻混匀，离心5000g×10min，取上层水相到另一管中。如水相仍不澄清，可重复此步骤数次。

5、加等体积氯仿，轻轻混匀，离心5000g×10min，取上层水相到另一管中。

6、加1/10体积的3M醋酸钠（pH52）和25倍体积的无水乙醇，轻轻倒置混匀。

7、待絮状物出现后，离心5000g×5min，弃上清液。

8、沉淀用75%乙醇洗涤，离心5000g×3min，弃上清液。

9、室温下挥发乙醇，待沉淀将近透明后加50-100mlTE溶解过夜。

植物组织中DNA的提取

试验原理：

脱氧核糖核酸（deoxribonucleicacid，DNA）是一切生物细胞的重要组成成分，主要存在于细胞核中，盐溶法是提取DNA的常规技术之一。从细胞中分离得到的DNA是与蛋白质结合的DNA，其中还含有大量RNA，即核糖核蛋白。如何有效地将这两种核蛋白分开是技术的关键。DNA不溶于014mol/L的NaCl溶液中，而RNA则能溶于014mol/L的NaCl溶液之中，利用这一性质就可以将二者从破碎细胞浆液中分开。制备过程中，细胞破碎的同时就有Dnase释放到提取液中，使DNA因被降解而影响得率，在提取缓冲液中加入适量的柠檬酸盐和EDTA，既可抑制酶的活性又可使蛋白质变性而与核酸分离，再加入阴离子去垢剂015％的SDS，经过2h搅拌，或用氯仿－异醇除去蛋白，通过离心使蛋白质沉淀而除去，得到的是含有核酸的上清液。然后用95％的预冷乙醇即可把DNA从除去蛋白质的提取液中沉淀出来。

植物DNA的SDS提取法：

试验试剂：

1、研磨缓冲液：称取5963gNaCl，1325g柠檬酸三钠，372gEDTA－Na分别溶解后合并为一，用02mol/L的NaOH调至pH70，并定容至1000ml。

2、10×SSC溶液：称取8766gNaCl和4412g柠檬酸三钠，分别溶解，一起定容至1000ml。

3、1×SSC溶液：用10×SSC溶液稀释10倍。

4、01×SSC溶液：用1×SSC溶液稀释10倍。

5、Rnase溶液：用014mol/LNaCl溶液配制成25mg/ml的酶液，用1mol/LHCl，pH至50，使用前经80℃水浴处理5min（以破坏可能存在的Dnase）。

6、氯仿－异戊醇：按24ml氯仿和1ml异戊醇混合。

7、5mol/L高氯酸钠溶液：称取NaClO4．H2O7023g，先加入少量蒸馏水溶解再容至100ml。

8、SDS（十二烷基硫酸钠）化学试剂的重结晶：将SDS放入无水酒精中达到饱和为止，然后在70～80℃的水浴中溶解，趁热过滤，冷却之后即将滤液放入冰箱，待结晶出现再置室温下凉干待用。

9、1mol／LHCl。

10、02mol/LNaOH。

11、二苯胺乙醛试剂：15g二苯胺溶于100ml冰醋酸中，添加15ml浓硫酸，装入棕色瓶，贮存暗处，使用时加01ml乙醛液〔浓乙醛：H2O＝1：50（V／V）〕。

12、10mol/L高酸溶液（HClO4）。

13、005mol/LNaOH。

14、DNA标准液：取标准DNA25mg溶于少量005molL-1NaOH中，再用005mol/LNaOH定容至25ml，后用移溶管吸取此液5ml至50ml容量瓶中，加50ml1mol/LHClO4，混合冷却后用05mol/LHClO4定容至刻度，则得100μg/ml的标准溶液。

实验步骤：

1、称取植物幼嫩组织10g剪碎置研钵中，加10ml预冷研磨缓冲液并加入01g左右的SDS，置冰浴上研磨成糊状。

2、将匀浆无损转入25ml刻度试管中加入等体积的氯仿－异戊醇混合液，加上塞子，剧烈振荡30s，转入离心管，静置片刻以脱除组织蛋白质。以4000rpm离心5min。

3、离心形成三层，小心地吸取上层清液至刻度试管中，弃去中间层的细胞碎片、变性蛋白质及下层的氯仿。

4、将试管置72℃水浴中保温3min（不超过4min），以灭活组织的DNA酶，然后迅速取出试管置冰水浴中冷却到室温，加5mol/L高氯酸钠溶液〔提取液：高氯酸钠溶液＝4：1（V／V）〕，使溶液中高氯酸钠的最终浓度为1mol/L。

5、再次加入等体积氯仿－异戊醇混合液至大试管中，振荡1min，静置后在室温下离心（4000rpm）5min，取上清液置小烧杯中。

6、用滴管吸95％的预冷乙醇，慢慢地加入烧杯中上清液的表面上，直至乙醇的体积为上清液的两倍，用玻璃棒轻轻搅动。此时核酸迅速以纤维状沉淀缠绕在玻璃棒上。

7、然后加入05ml左右的10×SSC，使最终浓度为1×SSC。

8、重复第6步骤和第7步骤即得到DNA的粗制品。

9、加入已处理的Rnase溶液，使其最后的作用浓度为50～70μg/ml，并在37℃水浴中保温30min，以除去RNA。

10、加入等体积的氯仿－异戊醇混合液，在三角瓶中振荡1min，再除去残留蛋白质及所加Rnase蛋白，室温下以4000rpm离心5min，收集上层水溶液。

11、再按6、7步骤处理即可得到纯化的DNA液。

植物DNA的CTAB提取法：

试验步骤：

1、称取新鲜叶片2-3g，剪碎放入研钵中，在液氮中研磨成粉末。

2、将粉末转移到加有7ml经预热的15×CTAB提取缓冲液15ml离心管中，迅速混匀后置于65℃水浴中，温育30min。

3、取出离心管,冷却至室温，加入氯仿/异戊醇(24:1)，充分混匀，室温下2300转离心20min。

4、将上清转移至另一新的15ml离心管中，加入1/10体积10%的CTAB和等体积的氯仿/异戊醇。充分混匀，2300rpm离心20min。

5、转移上清至另一新的15ml离心管中，加入等体积1%的CTAB沉淀缓冲液，轻轻摇晃至形成DNA絮状沉淀。1000rpm离心10min，使DNA沉淀于管底。

6、加入15-2ml的1mol/LNaCl及5μlRNase置于56℃水浴中过夜。

7、待DNA完全溶解后，加2-3ml4℃预冷的95%的冰乙醇使DNA沉淀，挑出DNA，置于15ml离心管中，用70%乙醇清洗30min。

8、离心机甩5s，倒出70%乙醇，再用95%乙醇浸泡5min，倒出95%乙醇，在超净工作台上吹干。

9、将风干的DNA直接在4℃保存备用或溶于100μlTE溶液中于-20℃保存。

细菌DNA的提取方法

针对一些不易于提取的细菌的方法:

试验试剂：

抽提缓冲液：2%CTAB(W/V)2%PVPK25(w/v)（去色素）100mMTris-HCl(pH80)

25mMEDTA(pH80)20MNaCl

10MLiCl

2MLiCl

DEPC-water（抑制RNA酶活性）

3MNaAc(pH52)

96%乙醇

70%乙醇

试验步骤：

1、抽提缓冲液65℃预热。

2、加菌体到已经预热的缓冲液（700ul）中混匀，65℃，10min。

3、加酚/氯仿/异戊醇（25：24：1），振荡，以12,000rpm，离心10min。

4、取上清，加氯仿/异戊醇（24：1）振荡，以12,000rpm，离心10min。

5、重复再作一次步骤4。

6、加入1/10体积的3M醋酸钠和15倍体积的乙醇（或加入等体积的异丙醇），－20C下沉淀。

7、以2,000rpm，离心10min。

8、弃上清，以70％乙醇条洗沉淀，也可以再用100％乙醇洗，然后溶解于100ml水中。

较为常用的细菌DNA提取方法：

实验步骤：

1、将菌株接种于液体LB培养基，37℃震荡培养过夜。

2、取15ml培养物12000rpm离心2min。

3、沉淀中加入567ul的TE缓冲液，反复吹打使之重新悬浮，加入30ul10%SDS和15ul的蛋白酶K，混匀，于37℃温育1h

4、加入100ul5mol/LNaCl,充分混匀，再加入80ulCTAB/NaCl溶液，混匀后再65℃温育10min。

5、加入等体积的酚/氯仿/异戊醇混匀，离心4-5min,将上清转入一只新管中，加入06-08倍体积的异丙醇，轻轻混合直到DNA沉淀下来，沉淀可稍加离心。

6、沉淀用1ml的70%乙醇洗涤后，离心弃乙醇．

真菌DNA提取总结的两种方法：

第一种方法：

试验步骤：

1、取真菌菌丝05g,在液氮中迅速研磨成粉。

2、加入4mL提取液，快速振荡混匀。

3、加入等体积的4mL的氯仿:异戊醇(24:1)，涡旋3～5min（此处是粗提没有加酚）。

4、以4℃，1000rpm，离心5min。

5、上清再用等体积的氯仿:异戊醇(24:1)抽提一次。以4℃，10,000rpm，离心5min。

6、取上清，加入2/3倍体积的-20℃预冷的异丙醇或25倍体积的无水乙醇沉淀,混匀,静置约30min。

7、用毛细玻棒挑出絮状沉淀,用75%乙醇反复漂洗数次,再用无水乙醇漂洗1次,吹干，重悬于500ulTE中。

8、加入1ulRNaseA（10mg/mL），37℃下处理1h。

9、用酚（pH80）:氯仿:异戊醇(25:24:1)和氯仿:异戊醇(24:1)各抽提1次。以4℃，10,000rpm，离心5min。

10、取上清，加入1/10倍体积的3MNaAc,25倍体积的无水乙醇,-70℃沉淀30min以上。

11、沉淀用75%乙醇漂洗，风干,溶于200ulTE中，-20℃保存备用。

DNA提取液：02MTris-HCl（pH75），05MNaCl，001MEDTA，1％SDS，3MNaAc。

第二种方法：

试验步骤：

1、真菌菌丝05-1g,在液氮中迅速研磨成粉。

2、加入3mL65℃预热的DNA提取缓冲液，快速振荡混匀65℃水浴30min,期间混匀2-3次。

3、加入1mL5MKAc，冰浴20min。

4、等体积的氯仿:异戊醇(24:1)抽提1次（10,000rpm，4℃离心5min）。

5、取上清，加入2/3倍体积的-20℃预冷异丙醇,混匀,静置约30min。

6、用毛细玻棒挑出絮状沉淀,用75%乙醇反复漂洗数次,再用无水乙醇漂洗1次,吹干，重悬于500ulTE中。

7、加入1ulRNaseA（10mg/mL），37℃处理1h。

8、用酚（pH80）:氯仿:异戊醇(25:24:1)和氯仿:异戊醇(24:1)各抽提1次。以4℃，10,000rpm，离心5min。

9、取上清，1/10V3MNaAc,25V体积的无水乙醇,-70℃沉淀30min以上。

10、沉淀用75%乙醇漂洗，风干,溶于200ulTE中，-20℃保存备用。

植物基因组提取(CATB法)

作者： 时间：2008-05-13 14:26:27 来源: 生物谷 浏览评论

一、实验目的

掌握植物总DNA的抽提方法和基本原理。学习根据不同的植物和实验要求设计和改良植物总DNA抽提方法。

二、实验原理

通常采用机械研磨的方法破碎植物的组织和细胞，由于植物细胞匀浆含有多种酶类(尤其是氧化酶类)对DNA的抽提产生不利的影响，在抽提缓冲液中需加入抗氧化剂或强还原剂(如巯基乙醇)以降低这些酶类的活性。在液氮中研磨，材料易于破碎，并减少研磨过程中各种酶类的作用。

十二烷基肌酸钠(sarkosyl)、十六烷基三甲基溴化铵(hexadyltrimethyl ammomum bromide，简称为CTAB)、十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate，简称SDS)等离子型表面活性剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使DNA得以游离出来。再加入苯酚和氯仿等有机溶剂，能使蛋白质变性，并使抽提液分相，因核酸(DNA、RNA)水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。上清液中加入无水乙醇使DNA沉淀，沉淀DNA溶于TE溶液中，即得植物总DNA溶液。

三、实验材料

水稻幼叶

四、主要配方

2% CTAB抽提缓冲溶液: CTAB 4g NaCl 16364 g 1M Tris-HCl 20ml( PH80) 05M EDTA 8ml，先用70ml ddH2O溶解, 再定容至200ml灭菌, 冷却后02-1% 2-巯基乙醇 （400ul） 氯仿-异戊醇（24：1）：先加96ml氯仿，再加4ml异戊醇，摇匀即可。

五、实验步骤

1 DNA的提取

（1） 2%CTAB抽提缓冲液在65℃水浴中预热。

（2）取少量叶片（约1g）置于研钵中，用液氮磨至粉状；

（3） 加入700ul的2%CTAB抽提缓冲液，轻轻搅动；

（4） 将磨碎液分倒入15 ml的灭菌中，磨碎液的高度约占管的三分之二；

（5）置于65℃的水浴槽或恒温箱中，每隔10 min轻轻摇动，40 min后取出；

（6）冷却2 min后，加入氯仿-异戊醇（24：1）至满管，剧烈振荡2~3 min，使两者混合均匀；

（7）放入离心机中10 000 rpm离心10 min，与此同时，将600 µl的异丙醇加入另一新的灭菌中；

（8） 10 000 rpm离心1 min后，移液器轻轻地吸取上清夜，转入含有异丙醇的内，将离心管慢慢上下摇动30 sec，使异丙醇与水层充分混合至能见到DNA絮状物；

（9）10000 rpm离心1 min后，立即倒掉液体，注意勿将白色DNA沉淀倒出，将离心管倒立于铺开的纸巾上； （10）60 sec后，直立离心管，加入720 µl的75%乙醇及80 µl 5 M的醋酸钠，轻轻转动，用手指弹管尖，使沉淀与管底的DNA块状物浮游于液体中；

（11）放置30 min，使DNA块状物的不纯物溶解；

（12）10000 rpm离心1 min后，倒掉液体，再加入800 µl 75%的乙醇，将DNA再洗 30 min；

（13）10000 rpm离心30 sec后，立即倒掉液体，将离心管倒立于铺开的纸巾上；数分钟后，直立离心管，干燥DNA（自然风干或用风筒吹干）；

（14）加入50 µl 05 × TE(含RNase)缓冲液，使DNA溶解，置于37℃恒温箱约15 h，使RNA消解；

（15）置于-20℃保存、备用。

2 DNA质量检测

琼脂糖电泳检测，原理和方法见实验二。

六、 注意事项

（1）叶片磨得越细越好。

（2）移液器的使用。

（3）由于植物细胞中含有大量的DNA酶，因此，除在抽提液中加入EDTA抑制酶的活性外，第一步的操作应迅速，以免组织解冻，导致细胞裂解，释放出DNA酶，使DNA降解。

提取基因组DNA和细胞核DNA是不同的方法

提取细胞核要先把细胞破碎分离出细胞核，要在甘油或其他保护剂中进行

SDS十二烷基磺酸钠：可破坏细胞膜、核膜，并使组织蛋白与DNA分离

CATB是一种抽提液，破坏细胞膜的~具体忘了~

DNA不溶于异丙醇，异丙醇可以析出DNA，产生白色絮状沉淀，用枪头挑出就可以了

以下是一些具体方法，希望有用

基因组DNA提取方法

制备基因组DNA是进行基因结构和功能研究的重要步骤，通常要求得到的片段的长度不小于100-200kb。在DNA提取过程中应尽量避免使DNA断裂和降解的各种因素，以保证DNA的完整性，为后续的实验打下基础。主要是CTAB方法，其他的方法还有1物理方式:玻璃珠法,超声波法,研磨法,冻融法。2化学方式：异硫氰酸胍法,碱裂解法3生物方式:酶法。根据核酸分离纯化方式的不同有:硅质材料、阴离子交换树脂等

试验步骤：

1、贴壁细胞用胰酶消化，离心收集。

2、细胞重悬于冰冷的PBS漂洗一次，离心收集。试验步骤2再重新作一边。

3、加入5mlDNA提取缓冲液，(10mmol/LTris-cl,01mol/LEDTA,o5%SDS),混匀。

4、加入25ul蛋白酶K,使终浓度达到100ug/ml,混匀，50℃水浴3h,

5、用等体积的酚抽提一次，2500rpm离心收集水相，用等体积的（酚，氯仿，异戊醇）混合物抽提一次，2500r/min离心收集水相

6、用等体积的氯仿，异戊醇抽提一次。加入等体积的5mol/L的LiCL,混匀，冰浴，10min。

7、2500rpm离心10min转上清于一离心管中。加入等体积的异丙醇。室温10min。

2500rpm,离心10min。弃上清。

8、加入01倍体积3mol/L乙酸钠(PH52)与2倍体积-20℃预冷无水乙醇。-20℃20min。

9、12000r/min,室温离心5min。弃上清。将DNA溶于适量TE中。

外周血DNA提取技术

分离外周血白细胞提取方法：

试验步骤：

1、取人肘静脉血5ml，EDTA抗凝，2500rpm离心10min。

2、小心吸取上层血浆，分装到3个05ml离心管中。

3、在血细胞中加入3倍体积的溶血液，摇匀，冰浴15min。

4、2500rpm离心10min，弃上清。

5、加入10ml溶血液，摇匀，冰浴15min。

6、3000rpm离心10min，弃上清。

7、倒置离心管，去掉残液。

8、得白细胞，－80C冻存。

试验要求：

血至分离白细胞之间隔时间在室温下放置不超过2h，4℃放置不超过5h，以防白细胞自溶。

氯仿法抽提外周血白细胞基因组DNA：

试验试剂：

Ligsisbuffer：

133mMNH4ClNHCl712g09mMNH4HCO3NH4HCO30071g01mMEDTA05mMEDTA02ml；最后加灭菌去离子水至1000ml，高压灭菌。

ACD抗凝剂：柠檬酸168g柠檬酸钠462g葡萄糖515g；最后加灭菌去离子水至350ml，高压灭菌。

提取缓冲液（Extractionbuffer）：

10mMTrisCl(PH=80)1MTrisCl(PH=80)1ml01mMEDTA(PH=80)05mMEDTA(PH=80)20ml05%SDS10%SDS05ml；最后加灭菌去离子水至100ml，高压灭菌

试验步骤：

1、在500μl抗凝血中加入ligsisbuffer1000μl，充分颠混至清亮。以4000rpm，离心5min。弃上清液。

2、沉淀中加入ligsisbuffer1500μl，充分匀浆。以6000rpm，离心5min。

3、彻底弃去上清，加入extractionbuffer500μl（裂解细胞），混匀置于37℃，水溶1h。

4、加入8μl的蛋白酶K，颠混，37℃过夜（或55℃，3h，但是37℃效果要好些）。

5、每管加入450μl饱和酚（取溶液下层）缓慢摇晃10min，以5500rpm，离心15min。

6、取上清，每管加入250μl饱和酚和250μl氯仿－异戊醇，摇匀10min，以5500rpm，离心15min。

7、取上清，每管加入500μl氯仿－异戊醇，摇匀10min，以5500rpm，离心15min。

8、取上清，每管加50μl的3M的NaAC＋，适量无水乙醇（预冷）至满，摇匀放入-20℃保存2h以上。

9、以12000rpm，离心20min。去上清，加入70％乙醇500μl，以12000rpm，离心5min，去上清，50－60℃干燥。

10、加入50μl灭菌去离子水，转弹，混匀。

NaI提取法提取外周血白细胞基因组：

实验步骤：

1、取外周抗凝血（全血）100ul于eppendorf管中，12000rpm离心12min。

2、弃上清，加双蒸水200ul溶解，摇匀20s。

3、混匀后加6MNaI溶液200ul，摇匀20s。

4、加入氯仿/异戊醇（24：1）400ul，边加边摇，摇匀20s，12000rpm离心12min。

5、取上层液350ul，加入另一新eppendorf管中，加06倍体积异丙醇，摇匀20s，室温放置15min，静置后的反应体系15000rpm离心12min，使沉淀紧贴eppendorf管壁。

6、弃异丙醇，加70％乙醇1ml（不振动），以15000rpm离心12min。

7、弃乙醇，敞开eppendorf管盖，烘干（37℃恒温箱）后，加1xTE溶液30ul，溶解DNA＞12h以上，制成的DNA液-20℃冰箱保存备用。

常用的外周血白细胞基因提取方法：

试验原理：

苯酚/氯仿提取DNA是利用酚是蛋白质的变性剂，反复抽提，使蛋白质变性，SDS(十二烷基磺酸钠)将细胞膜裂解，在蛋白酶K、EDTA的存在下消化蛋白质或多肽或小肽分子，核蛋白变性降解，使DNA从核蛋白中游离出来。DNA易溶于水，不溶于有机溶剂。蛋白质分子表面带有亲水基团，也容易进行水合作用，并在表面形成一层水化层，使蛋白质分子能顺利地进入到水溶液中形成稳定的胶体溶液。当有机溶液存在时，蛋白质的这种胶体稳定性遭到破坏，变性沉淀。离心后有机溶剂在试管底层(有机相)，DNA存在于上层水相中，蛋白质则沉淀于两相之间。酚-氯仿抽提的作用是除去未消化的蛋白质。氯仿的作用是有助于水相与有机相分离和除去DNA溶液中的酚。抽提后的DNA溶液用2倍体积的无水乙醇在1/103mol/LNaCl存在下沉淀DNA，回收DNA用70%乙醇洗去DNA沉淀中的盐，真空干燥，用TE缓冲液溶解DNA备用。

试验步骤：

1、将1mlEDTA抗凝贮冻血液于室温解冻后移入5ml离心管中，加入1ml磷酸缓冲盐溶液（PBS），混匀，3500rpm离心15min,倾去含裂解红细胞的上清。重复一次。用07mlDNA提取液混悬白细胞沉淀，37℃水浴温育1h。

2、将上述DNA提取液混悬白细胞，37℃水浴温育1h后，加入1mg/ml蛋白酶K02ml,至终浓度为100-200ug/ml,上下转动混匀，液体变粘稠。50℃水浴保温3h，裂解细胞，消化蛋白。保温过程中，应不时上下转动几次，混匀反应液。

3、反应液冷却至室温后，加入等体积的饱和酚溶液，温和地上下转动离心管5-10min，直至水相与酚相混匀成乳状液。5000rpm离心15min，用大口吸管小心吸取上层粘稠水相，移至另一离心管中。重复酚抽提一次。加等体积的氯仿：异戊醇（24：1），上下转动混匀，5000rpm离心15min，用大口吸管小心吸取上层粘稠水相，移至另一离心管中。重复一次。

4、加入1/5体积的3mol/LNaAc及2倍体积的预冷的无水乙醇，室温下慢慢摇动离心管，即有乳白色云絮状DNA出现。用玻璃棒小心挑取云絮状的DNA，转入另一15ml离心管中，加70%乙醇02ml，以5000rpm离心5min。洗涤DNA，弃上清，去除残留的盐。重复一次。室温挥发残留的乙醇，但不要让DNA完全干燥。加TE液20ul溶解DNA,置于摇床平台缓慢摇动，DNA完全溶解通常需12-24h。制成的DNA液-20℃冰箱保存备用。

真核细胞DNA的制备

一般真核细胞基因组DNA有107-9bp，可以从新鲜组织、培养细胞或低温保存的组织细胞中提取，常是采用在EDTA以及SDS等试剂存在下用蛋白酶K消化细胞，随后用酚抽提而实现的。这一方法获得的DNA不仅经酶切后可用于Southern分析，还可用于PCR的模板、文库构建等实验。

根据材料来源不同，采取不同的材料处理方法，而后的DNA提取方法大体类似，但都应考虑以下两个原则：

1、防止和抑制DNase对DNA的降解。

2、尽量减少对溶液中DNA的机械剪切破坏。

试剂准备：

1、TE:10mMTris-HCl(pH78);1mMEDTA(pH80)。

2、TBS:25mMTris-HCl(pH74);200mMNaCl;5mMKCl。

3、裂解缓冲液：250mMSDS;使用前加入蛋白酶K至100mg/ml。

4、20%SDS

5、2mg/ml蛋白酶K

6、Tris饱和酚（pH80）、酚/氯仿（酚∶氯仿=1∶1）、氯仿

7、无水乙醇、75%乙醇

试验步骤：

材料处理：

1、新鲜或冰冻组织处理：

1)取组织块03-05cm3,剪碎，加TE05ml，转移到匀浆器中匀浆。

2)将匀浆液转移到15ml离心管中。

3)加20%SDS25ml，蛋白酶K(2mg/ml)25ml，混匀。

4)60°C水浴1-3hr。

2、培养细胞处理：

1)将培养细胞悬浮后，用TBS洗涤一次。

2)离心4000g×5min，去除上清液。

3)加10倍体积的裂解缓冲液。

4)50-55°C水浴1-2hr。

DNA提取：

1、加等体积饱和酚至上述样品处理液中，温和、充分混匀3min。

2、离心5000g×10min，取上层水相到另一15ml离心管中。

3、加等体积饱和酚，混匀，离心5000g×10min，取上层水相到另一管中。

4、加等体积酚/氯仿，轻轻混匀，离心5000g×10min，取上层水相到另一管中。如水相仍不澄清，可重复此步骤数次。

5、加等体积氯仿，轻轻混匀，离心5000g×10min，取上层水相到另一管中。

6、加1/10体积的3M醋酸钠（pH52）和25倍体积的无水乙醇，轻轻倒置混匀。

7、待絮状物出现后，离心5000g×5min，弃上清液。

8、沉淀用75%乙醇洗涤，离心5000g×3min，弃上清液。

9、室温下挥发乙醇，待沉淀将近透明后加50-100mlTE溶解过夜。

植物组织中DNA的提取

试验原理：

脱氧核糖核酸（deoxribonucleicacid，DNA）是一切生物细胞的重要组成成分，主要存在于细胞核中，盐溶法是提取DNA的常规技术之一。从细胞中分离得到的DNA是与蛋白质结合的DNA，其中还含有大量RNA，即核糖核蛋白。如何有效地将这两种核蛋白分开是技术的关键。DNA不溶于014mol/L的NaCl溶液中，而RNA则能溶于014mol/L的NaCl溶液之中，利用这一性质就可以将二者从破碎细胞浆液中分开。制备过程中，细胞破碎的同时就有Dnase释放到提取液中，使DNA因被降解而影响得率，在提取缓冲液中加入适量的柠檬酸盐和EDTA，既可抑制酶的活性又可使蛋白质变性而与核酸分离，再加入阴离子去垢剂015％的SDS，经过2h搅拌，或用氯仿－异醇除去蛋白，通过离心使蛋白质沉淀而除去，得到的是含有核酸的上清液。然后用95％的预冷乙醇即可把DNA从除去蛋白质的提取液中沉淀出来。

植物DNA的SDS提取法：

试验试剂：

1、研磨缓冲液：称取5963gNaCl，1325g柠檬酸三钠，372gEDTA－Na分别溶解后合并为一，用02mol/L的NaOH调至pH70，并定容至1000ml。

2、10×SSC溶液：称取8766gNaCl和4412g柠檬酸三钠，分别溶解，一起定容至1000ml。

3、1×SSC溶液：用10×SSC溶液稀释10倍。

4、01×SSC溶液：用1×SSC溶液稀释10倍。

5、Rnase溶液：用014mol/LNaCl溶液配制成25mg/ml的酶液，用1mol/LHCl，pH至50，使用前经80℃水浴处理5min（以破坏可能存在的Dnase）。

6、氯仿－异戊醇：按24ml氯仿和1ml异戊醇混合。

7、5mol/L高氯酸钠溶液：称取NaClO4．H2O7023g，先加入少量蒸馏水溶解再容至100ml。

8、SDS（十二烷基硫酸钠）化学试剂的重结晶：将SDS放入无水酒精中达到饱和为止，然后在70～80℃的水浴中溶解，趁热过滤，冷却之后即将滤液放入冰箱，待结晶出现再置室温下凉干待用。

9、1mol／LHCl。

10、02mol/LNaOH。

11、二苯胺乙醛试剂：15g二苯胺溶于100ml冰醋酸中，添加15ml浓硫酸，装入棕色瓶，贮存暗处，使用时加01ml乙醛液〔浓乙醛：H2O＝1：50（V／V）〕。

12、10mol/L高酸溶液（HClO4）。

13、005mol/LNaOH。

14、DNA标准液：取标准DNA25mg溶于少量005molL-1NaOH中，再用005mol/LNaOH定容至25ml，后用移溶管吸取此液5ml至50ml容量瓶中，加50ml1mol/LHClO4，混合冷却后用05mol/LHClO4定容至刻度，则得100μg/ml的标准溶液。

实验步骤：

1、称取植物幼嫩组织10g剪碎置研钵中，加10ml预冷研磨缓冲液并加入01g左右的SDS，置冰浴上研磨成糊状。

2、将匀浆无损转入25ml刻度试管中加入等体积的氯仿－异戊醇混合液，加上塞子，剧烈振荡30s，转入离心管，静置片刻以脱除组织蛋白质。以4000rpm离心5min。

3、离心形成三层，小心地吸取上层清液至刻度试管中，弃去中间层的细胞碎片、变性蛋白质及下层的氯仿。

4、将试管置72℃水浴中保温3min（不超过4min），以灭活组织的DNA酶，然后迅速取出试管置冰水浴中冷却到室温，加5mol/L高氯酸钠溶液〔提取液：高氯酸钠溶液＝4：1（V／V）〕，使溶液中高氯酸钠的最终浓度为1mol/L。

5、再次加入等体积氯仿－异戊醇混合液至大试管中，振荡1min，静置后在室温下离心（4000rpm）5min，取上清液置小烧杯中。

6、用滴管吸95％的预冷乙醇，慢慢地加入烧杯中上清液的表面上，直至乙醇的体积为上清液的两倍，用玻璃棒轻轻搅动。此时核酸迅速以纤维状沉淀缠绕在玻璃棒上。

7、然后加入05ml左右的10×SSC，使最终浓度为1×SSC。

8、重复第6步骤和第7步骤即得到DNA的粗制品。

9、加入已处理的Rnase溶液，使其最后的作用浓度为50～70μg/ml，并在37℃水浴中保温30min，以除去RNA。

10、加入等体积的氯仿－异戊醇混合液，在三角瓶中振荡1min，再除去残留蛋白质及所加Rnase蛋白，室温下以4000rpm离心5min，收集上层水溶液。

11、再按6、7步骤处理即可得到纯化的DNA液。

植物DNA的CTAB提取法：

试验步骤：

1、称取新鲜叶片2-3g，剪碎放入研钵中，在液氮中研磨成粉末。

2、将粉末转移到加有7ml经预热的15×CTAB提取缓冲液15ml离心管中，迅速混匀后置于65℃水浴中，温育30min。

3、取出离心管,冷却至室温，加入氯仿/异戊醇(24:1)，充分混匀，室温下2300转离心20min。

4、将上清转移至另一新的15ml离心管中，加入1/10体积10%的CTAB和等体积的氯仿/异戊醇。充分混匀，2300rpm离心20min。

5、转移上清至另一新的15ml离心管中，加入等体积1%的CTAB沉淀缓冲液，轻轻摇晃至形成DNA絮状沉淀。1000rpm离心10min，使DNA沉淀于管底。

6、加入15-2ml的1mol/LNaCl及5μlRNase置于56℃水浴中过夜。

7、待DNA完全溶解后，加2-3ml4℃预冷的95%的冰乙醇使DNA沉淀，挑出DNA，置于15ml离心管中，用70%乙醇清洗30min。

8、离心机甩5s，倒出70%乙醇，再用95%乙醇浸泡5min，倒出95%乙醇，在超净工作台上吹干。

9、将风干的DNA直接在4℃保存备用或溶于100μlTE溶液中于-20℃保存。

细菌DNA的提取方法

针对一些不易于提取的细菌的方法:

试验试剂：

抽提缓冲液：2%CTAB(W/V)2%PVPK25(w/v)（去色素）100mMTris-HCl(pH80)

25mMEDTA(pH80)20MNaCl

10MLiCl

2MLiCl

DEPC-water（抑制RNA酶活性）

3MNaAc(pH52)

96%乙醇

70%乙醇

试验步骤：

1、抽提缓冲液65℃预热。

2、加菌体到已经预热的缓冲液（700ul）中混匀，65℃，10min。

3、加酚/氯仿/异戊醇（25：24：1），振荡，以12,000rpm，离心10min。

4、取上清，加氯仿/异戊醇（24：1）振荡，以12,000rpm，离心10min。

5、重复再作一次步骤4。

6、加入1/10体积的3M醋酸钠和15倍体积的乙醇（或加入等体积的异丙醇），－20C下沉淀。

7、以2,000rpm，离心10min。

8、弃上清，以70％乙醇条洗沉淀，也可以再用100％乙醇洗，然后溶解于100ml水中。

较为常用的细菌DNA提取方法：

实验步骤：

1、将菌株接种于液体LB培养基，37℃震荡培养过夜。

2、取15ml培养物12000rpm离心2min。

3、沉淀中加入567ul的TE缓冲液，反复吹打使之重新悬浮，加入30ul10%SDS和15ul的蛋白酶K，混匀，于37℃温育1h

4、加入100ul5mol/LNaCl,充分混匀，再加入80ulCTAB/NaCl溶液，混匀后再65℃温育10min。

5、加入等体积的酚/氯仿/异戊醇混匀，离心4-5min,将上清转入一只新管中，加入06-08倍体积的异丙醇，轻轻混合直到DNA沉淀下来，沉淀可稍加离心。

6、沉淀用1ml的70%乙醇洗涤后，离心弃乙醇．

真菌DNA提取总结的两种方法：

第一种方法：

试验步骤：

1、取真菌菌丝05g,在液氮中迅速研磨成粉。

2、加入4mL提取液，快速振荡混匀。

3、加入等体积的4mL的氯仿:异戊醇(24:1)，涡旋3～5min（此处是粗提没有加酚）。

4、以4℃，1000rpm，离心5min。

5、上清再用等体积的氯仿:异戊醇(24:1)抽提一次。以4℃，10,000rpm，离心5min。

6、取上清，加入2/3倍体积的-20℃预冷的异丙醇或25倍体积的无水乙醇沉淀,混匀,静置约30min。

7、用毛细玻棒挑出絮状沉淀,用75%乙醇反复漂洗数次,再用无水乙醇漂洗1次,吹干，重悬于500ulTE中。

8、加入1ulRNaseA（10mg/mL），37℃下处理1h。

9、用酚（pH80）:氯仿:异戊醇(25:24:1)和氯仿:异戊醇(24:1)各抽提1次。以4℃，10,000rpm，离心5min。

10、取上清，加入1/10倍体积的3MNaAc,25倍体积的无水乙醇,-70℃沉淀30min以上。

11、沉淀用75%乙醇漂洗，风干,溶于200ulTE中，-20℃保存备用。

DNA提取液：02MTris-HCl（pH75），05MNaCl，001MEDTA，1％SDS，3MNaAc。

第二种方法：

试验步骤：

1、真菌菌丝05-1g,在液氮中迅速研磨成粉。

2、加入3mL65℃预热的DNA提取缓冲液，快速振荡混匀65℃水浴30min,期间混匀2-3次。

3、加入1mL5MKAc，冰浴20min。

4、等体积的氯仿:异戊醇(24:1)抽提1次（10,000rpm，4℃离心5min）。

5、取上清，加入2/3倍体积的-20℃预冷异丙醇,混匀,静置约30min。

6、用毛细玻棒挑出絮状沉淀,用75%乙醇反复漂洗数次,再用无水乙醇漂洗1次,吹干，重悬于500ulTE中。

7、加入1ulRNaseA（10mg/mL），37℃处理1h。

8、用酚（pH80）:氯仿:异戊醇(25:24:1)和氯仿:异戊醇(24:1)各抽提1次。以4℃，10,000rpm，离心5min。

9、取上清，1/10V3MNaAc,25V体积的无水乙醇,-70℃沉淀30min以上。

10、沉淀用75%乙醇漂洗，风干,溶于200ulTE中，-20℃保存备用。

植物基因组提取(CATB法)

作者： 时间：2008-05-13 14:26:27 来源: 生物谷 浏览评论

一、实验目的

掌握植物总DNA的抽提方法和基本原理。学习根据不同的植物和实验要求设计和改良植物总DNA抽提方法。

二、实验原理

通常采用机械研磨的方法破碎植物的组织和细胞，由于植物细胞匀浆含有多种酶类(尤其是氧化酶类)对DNA的抽提产生不利的影响，在抽提缓冲液中需加入抗氧化剂或强还原剂(如巯基乙醇)以降低这些酶类的活性。在液氮中研磨，材料易于破碎，并减少研磨过程中各种酶类的作用。

十二烷基肌酸钠(sarkosyl)、十六烷基三甲基溴化铵(hexadyltrimethyl ammomum bromide，简称为CTAB)、十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate，简称SDS)等离子型表面活性剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使DNA得以游离出来。再加入苯酚和氯仿等有机溶剂，能使蛋白质变性，并使抽提液分相，因核酸(DNA、RNA)水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。上清液中加入无水乙醇使DNA沉淀，沉淀DNA溶于TE溶液中，即得植物总DNA溶液。

三、实验材料

水稻幼叶

四、主要配方

2% CTAB抽提缓冲溶液: CTAB 4g NaCl 16364 g 1M Tris-HCl 20ml( PH80) 05M EDTA 8ml，先用70ml ddH2O溶解, 再定容至200ml灭菌, 冷却后02-1% 2-巯基乙醇 （400ul） 氯仿-异戊醇（24：1）：先加96ml氯仿，再加4ml异戊醇，摇匀即可。

五、实验步骤

1 DNA的提取

（1） 2%CTAB抽提缓冲液在65℃水浴中预热。

（2）取少量叶片（约1g）置于研钵中，用液氮磨至粉状；

（3） 加入700ul的2%CTAB抽提缓冲液，轻轻搅动；

（4） 将磨碎液分倒入15 ml的灭菌中，磨碎液的高度约占管的三分之二；

（5）置于65℃的水浴槽或恒温箱中，每隔10 min轻轻摇动，40 min后取出；

（6）冷却2 min后，加入氯仿-异戊醇（24：1）至满管，剧烈振荡2~3 min，使两者混合均匀；

（7）放入离心机中10 000 rpm离心10 min，与此同时，将600 µl的异丙醇加入另一新的灭菌中；

（8） 10 000 rpm离心1 min后，移液器轻轻地吸取上清夜，转入含有异丙醇的内，将离心管慢慢上下摇动30 sec，使异丙醇与水层充分混合至能见到DNA絮状物；

（9）10000 rpm离心1 min后，立即倒掉液体，注意勿将白色DNA沉淀倒出，将离心管倒立于铺开的纸巾上； （10）60 sec后，直立离心管，加入720 µl的75%乙醇及80 µl 5 M的醋酸钠，轻轻转动，用手指弹管尖，使沉淀与管底的DNA块状物浮游于液体中；

（11）放置30 min，使DNA块状物的不纯物溶解；

（12）10000 rpm离心1 min后，倒掉液体，再加入800 µl 75%的乙醇，将DNA再洗 30 min；

（13）10000 rpm离心30 sec后，立即倒掉液体，将离心管倒立于铺开的纸巾上；数分钟后，直立离心管，干燥DNA（自然风干或用风筒吹干）；

（14）加入50 µl 05 × TE(含RNase)缓冲液，使DNA溶解，置于37℃恒温箱约15 h，使RNA消解；

（15）置于-20℃保存、备用。

2 DNA质量检测

琼脂糖电泳检测，原理和方法见实验二。

六、 注意事项

（1）叶片磨得越细越好。

（2）移液器的使用。

（3）由于植物细胞中含有大量的DNA酶，因此，除在抽提液中加入EDTA抑制酶的活性外，第一步的操作应迅速，以免组织解冻，导致细胞裂解，释放出DNA酶，使DNA降解。

提取基因组DNA和细胞核DNA是不同的方法

提取细胞核要先把细胞破碎分离出细胞核，要在甘油或其他保护剂中进行

SDS十二烷基磺酸钠：可破坏细胞膜、核膜，并使组织蛋白与DNA分离

CATB是一种抽提液，破坏细胞膜的~具体忘了~

DNA不溶于异丙醇，异丙醇可以析出DNA，产生白色絮状沉淀，用枪头挑出就可以了

以下是一些具体方法，希望有用

基因组DNA提取方法

制备基因组DNA是进行基因结构和功能研究的重要步骤，通常要求得到的片段的长度不小于100-200kb。在DNA提取过程中应尽量避免使DNA断裂和降解的各种因素，以保证DNA的完整性，为后续的实验打下基础。主要是CTAB方法，其他的方法还有1物理方式:玻璃珠法,超声波法,研磨法,冻融法。2化学方式：异硫氰酸胍法,碱裂解法3生物方式:酶法。根据核酸分离纯化方式的不同有:硅质材料、阴离子交换树脂等

试验步骤：

1、贴壁细胞用胰酶消化，离心收集。

2、细胞重悬于冰冷的PBS漂洗一次，离心收集。试验步骤2再重新作一边。

3、加入5mlDNA提取缓冲液，(10mmol/LTris-cl,01mol/LEDTA,o5%SDS),混匀。

4、加入25ul蛋白酶K,使终浓度达到100ug/ml,混匀，50℃水浴3h,

5、用等体积的酚抽提一次，2500rpm离心收集水相，用等体积的（酚，氯仿，异戊醇）混合物抽提一次，2500r/min离心收集水相

6、用等体积的氯仿，异戊醇抽提一次。加入等体积的5mol/L的LiCL,混匀，冰浴，10min。

7、2500rpm离心10min转上清于一离心管中。加入等体积的异丙醇。室温10min。

2500rpm,离心10min。弃上清。

8、加入01倍体积3mol/L乙酸钠(PH52)与2倍体积-20℃预冷无水乙醇。-20℃20min。

9、12000r/min,室温离心5min。弃上清。将DNA溶于适量TE中。

外周血DNA提取技术

分离外周血白细胞提取方法：

试验步骤：

1、取人肘静脉血5ml，EDTA抗凝，2500rpm离心10min。

2、小心吸取上层血浆，分装到3个05ml离心管中。

3、在血细胞中加入3倍体积的溶血液，摇匀，冰浴15min。

4、2500rpm离心10min，弃上清。

5、加入10ml溶血液，摇匀，冰浴15min。

6、3000rpm离心10min，弃上清。

7、倒置离心管，去掉残液。

8、得白细胞，－80C冻存。

试验要求：

血至分离白细胞之间隔时间在室温下放置不超过2h，4℃放置不超过5h，以防白细胞自溶。

氯仿法抽提外周血白细胞基因组DNA：

试验试剂：

Ligsisbuffer：

133mMNH4ClNHCl712g09mMNH4HCO3NH4HCO30071g01mMEDTA05mMEDTA02ml；最后加灭菌去离子水至1000ml，高压灭菌。

ACD抗凝剂：柠檬酸168g柠檬酸钠462g葡萄糖515g；最后加灭菌去离子水至350ml，高压灭菌。

提取缓冲液（Extractionbuffer）：

10mMTrisCl(PH=80)1MTrisCl(PH=80)1ml01mMEDTA(PH=80)05mMEDTA(PH=80)20ml05%SDS10%SDS05ml；最后加灭菌去离子水至100ml，高压灭菌

试验步骤：

1、在500μl抗凝血中加入ligsisbuffer1000μl，充分颠混至清亮。以4000rpm，离心5min。弃上清液。

2、沉淀中加入ligsisbuffer1500μl，充分匀浆。以6000rpm，离心5min。

3、彻底弃去上清，加入extractionbuffer500μl（裂解细胞），混匀置于37℃，水溶1h。

4、加入8μl的蛋白酶K，颠混，37℃过夜（或55℃，3h，但是37℃效果要好些）。

5、每管加入450μl饱和酚（取溶液下层）缓慢摇晃10min，以5500rpm，离心15min。

6、取上清，每管加入250μl饱和酚和250μl氯仿－异戊醇，摇匀10min，以5500rpm，离心15min。

7、取上清，每管加入500μl氯仿－异戊醇，摇匀10min，以5500rpm，离心15min。

8、取上清，每管加50μl的3M的NaAC＋，适量无水乙醇（预冷）至满，摇匀放入-20℃保存2h以上。

9、以12000rpm，离心20min。去上清，加入70％乙醇500μl，以12000rpm，离心5min，去上清，50－60℃干燥。

10、加入50μl灭菌去离子水，转弹，混匀。

NaI提取法提取外周血白细胞基因组：

实验步骤：

1、取外周抗凝血（全血）100ul于eppendorf管中，12000rpm离心12min。

2、弃上清，加双蒸水200ul溶解，摇匀20s。

3、混匀后加6MNaI溶液200ul，摇匀20s。

4、加入氯仿/异戊醇（24：1）400ul，边加边摇，摇匀20s，12000rpm离心12min。

5、取上层液350ul，加入另一新eppendorf管中，加06倍体积异丙醇，摇匀20s，室温放置15min，静置后的反应体系15000rpm离心12min，使沉淀紧贴eppendorf管壁。

6、弃异丙醇，加70％乙醇1ml（不振动），以15000rpm离心12min。

7、弃乙醇，敞开eppendorf管盖，烘干（37℃恒温箱）后，加1xTE溶液30ul，溶解DNA＞12h以上，制成的DNA液-20℃冰箱保存备用。

常用的外周血白细胞基因提取方法：

试验原理：

苯酚/氯仿提取DNA是利用酚是蛋白质的变性剂，反复抽提，使蛋白质变性，SDS(十二烷基磺酸钠)将细胞膜裂解，在蛋白酶K、EDTA的存在下消化蛋白质或多肽或小肽分子，核蛋白变性降解，使DNA从核蛋白中游离出来。DNA易溶于水，不溶于有机溶剂。蛋白质分子表面带有亲水基团，也容易进行水合作用，并在表面形成一层水化层，使蛋白质分子能顺利地进入到水溶液中形成稳定的胶体溶液。当有机溶液存在时，蛋白质的这种胶体稳定性遭到破坏，变性沉淀。离心后有机溶剂在试管底层(有机相)，DNA存在于上层水相中，蛋白质则沉淀于两相之间。酚-氯仿抽提的作用是除去未消化的蛋白质。氯仿的作用是有助于水相与有机相分离和除去DNA溶液中的酚。抽提后的DNA溶液用2倍体积的无水乙醇在1/103mol/LNaCl存在下沉淀DNA，回收DNA用70%乙醇洗去DNA沉淀中的盐，真空干燥，用TE缓冲液溶解DNA备用。

试验步骤：

1、将1mlEDTA抗凝贮冻血液于室温解冻后移入5ml离心管中，加入1ml磷酸缓冲盐溶液（PBS），混匀，3500rpm离心15min,倾去含裂解红细胞的上清。重复一次。用07mlDNA提取液混悬白细胞沉淀，37℃水浴温育1h。

2、将上述DNA提取液混悬白细胞，37℃水浴温育1h后，加入1mg/ml蛋白酶K02ml,至终浓度为100-200ug/ml,上下转动混匀，液体变粘稠。50℃水浴保温3h，裂解细胞，消化蛋白。保温过程中，应不时上下转动几次，混匀反应液。

3、反应液冷却至室温后，加入等体积的饱和酚溶液，温和地上下转动离心管5-10min，直至水相与酚相混匀成乳状液。5000rpm离心15min，用大口吸管小心吸取上层粘稠水相，移至另一离心管中。重复酚抽提一次。加等体积的氯仿：异戊醇（24：1），上下转动混匀，5000rpm离心15min，用大口吸管小心吸取上层粘稠水相，移至另一离心管中。重复一次。

4、加入1/5体积的3mol/LNaAc及2倍体积的预冷的无水乙醇，室温下慢慢摇动离心管，即有乳白色云絮状DNA出现。用玻璃棒小心挑取云絮状的DNA，转入另一15ml离心管中，加70%乙醇02ml，以5000rpm离心5min。洗涤DNA，弃上清，去除残留的盐。重复一次。室温挥发残留的乙醇，但不要让DNA完全干燥。加TE液20ul溶解DNA,置于摇床平台缓慢摇动，DNA完全溶解通常需12-24h。制成的DNA液-20℃冰箱保存备用。

真核细胞DNA的制备

一般真核细胞基因组DNA有107-9bp，可以从新鲜组织、培养细胞或低温保存的组织细胞中提取，常是采用在EDTA以及SDS等试剂存在下用蛋白酶K消化细胞，随后用酚抽提而实现的。这一方法获得的DNA不仅经酶切后可用于Southern分析，还可用于PCR的模板、文库构建等实验。

根据材料来源不同，采取不同的材料处理方法，而后的DNA提取方法大体类似，但都应考虑以下两个原则：

1、防止和抑制DNase对DNA的降解。

2、尽量减少对溶液中DNA的机械剪切破坏。

试剂准备：

1、TE:10mMTris-HCl(pH78);1mMEDTA(pH80)。

2、TBS:25mMTris-HCl(pH74);200mMNaCl;5mMKCl。

3、裂解缓冲液：250mMSDS;使用前加入蛋白酶K至100mg/ml。

4、20%SDS

5、2mg/ml蛋白酶K

6、Tris饱和酚（pH80）、酚/氯仿（酚∶氯仿=1∶1）、氯仿

7、无水乙醇、75%乙醇

试验步骤：

材料处理：

1、新鲜或冰冻组织处理：

1)取组织块03-05cm3,剪碎，加TE05ml，转移到匀浆器中匀浆。

2)将匀浆液转移到15ml离心管中。

3)加20%SDS25ml，蛋白酶K(2mg/ml)25ml，混匀。

4)60°C水浴1-3hr。

2、培养细胞处理：

1)将培养细胞悬浮后，用TBS洗涤一次。

2)离心4000g×5min，去除上清液。

3)加10倍体积的裂解缓冲液。

4)50-55°C水浴1-2hr。

DNA提取：

1、加等体积饱和酚至上述样品处理液中，温和、充分混匀3min。

2、离心5000g×10min，取上层水相到另一15ml离心管中。

3、加等体积饱和酚，混匀，离心5000g×10min，取上层水相到另一管中。

4、加等体积酚/氯仿，轻轻混匀，离心5000g×10min，取上层水相到另一管中。如水相仍不澄清，可重复此步骤数次。

5、加等体积氯仿，轻轻混匀，离心5000g×10min，取上层水相到另一管中。

6、加1/10体积的3M醋酸钠（pH52）和25倍体积的无水乙醇，轻轻倒置混匀。

7、待絮状物出现后，离心5000g×5min，弃上清液。

8、沉淀用75%乙醇洗涤，离心5000g×3min，弃上清液。

9、室温下挥发乙醇，待沉淀将近透明后加50-100mlTE溶解过夜。

植物组织中DNA的提取

试验原理：

脱氧核糖核酸（deoxribonucleicacid，DNA）是一切生物细胞的重要组成成分，主要存在于细胞核中，盐溶法是提取DNA的常规技术之一。从细胞中分离得到的DNA是与蛋白质结合的DNA，其中还含有大量RNA，即核糖核蛋白。如何有效地将这两种核蛋白分开是技术的关键。DNA不溶于014mol/L的NaCl溶液中，而RNA则能溶于014mol/L的NaCl溶液之中，利用这一性质就可以将二者从破碎细胞浆液中分开。制备过程中，细胞破碎的同时就有Dnase释放到提取液中，使DNA因被降解而影响得率，在提取缓冲液中加入适量的柠檬酸盐和EDTA，既可抑制酶的活性又可使蛋白质变性而与核酸分离，再加入阴离子去垢剂015％的SDS，经过2h搅拌，或用氯仿－异醇除去蛋白，通过离心使蛋白质沉淀而除去，得到的是含有核酸的上清液。然后用95％的预冷乙醇即可把DNA从除去蛋白质的提取液中沉淀出来。

植物DNA的SDS提取法：

试验试剂：

1、研磨缓冲液：称取5963gNaCl，1325g柠檬酸三钠，372gEDTA－Na分别溶解后合并为一，用02mol/L的NaOH调至pH70，并定容至1000ml。

2、10×SSC溶液：称取8766gNaCl和4412g柠檬酸三钠，分别溶解，一起定容至1000ml。

3、1×SSC溶液：用10×SSC溶液稀释10倍。

4、01×SSC溶液：用1×SSC溶液稀释10倍。

5、Rnase溶液：用014mol/LNaCl溶液配制成25mg/ml的酶液，用1mol/LHCl，pH至50，使用前经80℃水浴处理5min（以破坏可能存在的Dnase）。

6、氯仿－异戊醇：按24ml氯仿和1ml异戊醇混合。

7、5mol/L高氯酸钠溶液：称取NaClO4．H2O7023g，先加入少量蒸馏水溶解再容至100ml。

8、SDS（十二烷基硫酸钠）化学试剂的重结晶：将SDS放入无水酒精中达到饱和为止，然后在70～80℃的水浴中溶解，趁热过滤，冷却之后即将滤液放入冰箱，待结晶出现再置室温下凉干待用。

9、1mol／LHCl。

10、02mol/LNaOH。

11、二苯胺乙醛试剂：15g二苯胺溶于100ml冰醋酸中，添加15ml浓硫酸，装入棕色瓶，贮存暗处，使用时加01ml乙醛液〔浓乙醛：H2O＝1：50（V／V）〕。

12、10mol/L高酸溶液（HClO4）。

13、005mol/LNaOH。

14、DNA标准液：取标准DNA25mg溶于少量005molL-1NaOH中，再用005mol/LNaOH定容至25ml，后用移溶管吸取此液5ml至50ml容量瓶中，加50ml1mol/LHClO4，混合冷却后用05mol/LHClO4定容至刻度，则得100μg/ml的标准溶液。

实验步骤：

1、称取植物幼嫩组织10g剪碎置研钵中，加10ml预冷研磨缓冲液并加入01g左右的SDS，置冰浴上研磨成糊状。

2、将匀浆无损转入25ml刻度试管中加入等体积的氯仿－异戊醇混合液，加上塞子，剧烈振荡30s，转入离心管，静置片刻以脱除组织蛋白质。以4000rpm离心5min。

3、离心形成三层，小心地吸取上层清液至刻度试管中，弃去中间层的细胞碎片、变性蛋白质及下层的氯仿。

4、将试管置72℃水浴中保温3min（不超过4min），以灭活组织的DNA酶，然后迅速取出试管置冰水浴中冷却到室温，加5mol/L高氯酸钠溶液〔提取液：高氯酸钠溶液＝4：1（V／V）〕，使溶液中高氯酸钠的最终浓度为1mol/L。

5、再次加入等体积氯仿－异戊醇混合液至大试管中，振荡1min，静置后在室温下离心（4000rpm）5min，取上清液置小烧杯中。

6、用滴管吸95％的预冷乙醇，慢慢地加入烧杯中上清液的表面上，直至乙醇的体积为上清液的两倍，用玻璃棒轻轻搅动。此时核酸迅速以纤维状沉淀缠绕在玻璃棒上。

7、然后加入05ml左右的10×SSC，使最终浓度为1×SSC。

8、重复第6步骤和第7步骤即得到DNA的粗制品。

9、加入已处理的Rnase溶液，使其最后的作用浓度为50～70μg/ml，并在37℃水浴中保温30min，以除去RNA。

10、加入等体积的氯仿－异戊醇混合液，在三角瓶中振荡1min，再除去残留蛋白质及所加Rnase蛋白，室温下以4000rpm离心5min，收集上层水溶液。

11、再按6、7步骤处理即可得到纯化的DNA液。

植物DNA的CTAB提取法：

试验步骤：

1、称取新鲜叶片2-3g，剪碎放入研钵中，在液氮中研磨成粉末。

2、将粉末转移到加有7ml经预热的15×CTAB提取缓冲液15ml离心管中，迅速混匀后置于65℃水浴中，温育30min。

3、取出离心管,冷却至室温，加入氯仿/异戊醇(24:1)，充分混匀，室温下2300转离心20min。

4、将上清转移至另一新的15ml离心管中，加入1/10体积10%的CTAB和等体积的氯仿/异戊醇。充分混匀，2300rpm离心20min。

5、转移上清至另一新的15ml离心管中，加入等体积1%的CTAB沉淀缓冲液，轻轻摇晃至形成DNA絮状沉淀。1000rpm离心10min，使DNA沉淀于管底。

6、加入15-2ml的1mol/LNaCl及5μlRNase置于56℃水浴中过夜。

7、待DNA完全溶解后，加2-3ml4℃预冷的95%的冰乙醇使DNA沉淀，挑出DNA，置于15ml离心管中，用70%乙醇清洗30min。

8、离心机甩5s，倒出70%乙醇，再用95%乙醇浸泡5min，倒出95%乙醇，在超净工作台上吹干。

9、将风干的DNA直接在4℃保存备用或溶于100μlTE溶液中于-20℃保存。

细菌DNA的提取方法

针对一些不易于提取的细菌的方法:

试验试剂：

抽提缓冲液：2%CTAB(W/V)2%PVPK25(w/v)（去色素）100mMTris-HCl(pH80)

25mMEDTA(pH80)20MNaCl

10MLiCl

2MLiCl

DEPC-water（抑制RNA酶活性）

3MNaAc(pH52)

96%乙醇

70%乙醇

试验步骤：

1、抽提缓冲液65℃预热。

2、加菌体到已经预热的缓冲液（700ul）中混匀，65℃，10min。

3、加酚/氯仿/异戊醇（25：24：1），振荡，以12,000rpm，离心10min。

4、取上清，加氯仿/异戊醇（24：1）振荡，以12,000rpm，离心10min。

5、重复再作一次步骤4。

6、加入1/10体积的3M醋酸钠和15倍体积的乙醇（或加入等体积的异丙醇），－20C下沉淀。

7、以2,000rpm，离心10min。

8、弃上清，以70％乙醇条洗沉淀，也可以再用100％乙醇洗，然后溶解于100ml水中。

较为常用的细菌DNA提取方法：

实验步骤：

1、将菌株接种于液体LB培养基，37℃震荡培养过夜。

2、取15ml培养物12000rpm离心2min。

3、沉淀中加入567ul的TE缓冲液，反复吹打使之重新悬浮，加入30ul10%SDS和15ul的蛋白酶K，混匀，于37℃温育1h

4、加入100ul5mol/LNaCl,充分混匀，再加入80ulCTAB/NaCl溶液，混匀后再65℃温育10min。

5、加入等体积的酚/氯仿/异戊醇混匀，离心4-5min,将上清转入一只新管中，加入06-08倍体积的异丙醇，轻轻混合直到DNA沉淀下来，沉淀可稍加离心。

6、沉淀用1ml的70%乙醇洗涤后，离心弃乙醇．

真菌DNA提取总结的两种方法：

第一种方法：

试验步骤：

1、取真菌菌丝05g,在液氮中迅速研磨成粉。

2、加入4mL提取液，快速振荡混匀。

3、加入等体积的4mL的氯仿:异戊醇(24:1)，涡旋3～5min（此处是粗提没有加酚）。

4、以4℃，1000rpm，离心5min。

5、上清再用等体积的氯仿:异戊醇(24:1)抽提一次。以4℃，10,000rpm，离心5min。

6、取上清，加入2/3倍体积的-20℃预冷的异丙醇或25倍体积的无水乙醇沉淀,混匀,静置约30min。

7、用毛细玻棒挑出絮状沉淀,用75%乙醇反复漂洗数次,再用无水乙醇漂洗1次,吹干，重悬于500ulTE中。

8、加入1ulRNaseA（10mg/mL），37℃下处理1h。

9、用酚（pH80）:氯仿:异戊醇(25:24:1)和氯仿:异戊醇(24:1)各抽提1次。以4℃，10,000rpm，离心5min。

10、取上清，加入1/10倍体积的3MNaAc,25倍体积的无水乙醇,-70℃沉淀30min以上。

11、沉淀用75%乙醇漂洗，风干,溶于200ulTE中，-20℃保存备用。

DNA提取液：02MTris-HCl（pH75），05MNaCl，001MEDTA，1％SDS，3MNaAc。

第二种方法：

试验步骤：

1、真菌菌丝05-1g,在液氮中迅速研磨成粉。

2、加入3mL65℃预热的DNA提取缓冲液，快速振荡混匀65℃水浴30min,期间混匀2-3次。

3、加入1mL5MKAc，冰浴20min。

4、等体积的氯仿:异戊醇(24:1)抽提1次（10,000rpm，4℃离心5min）。

5、取上清，加入2/3倍体积的-20℃预冷异丙醇,混匀,静置约30min。

6、用毛细玻棒挑出絮状沉淀,用75%乙醇反复漂洗数次,再用无水乙醇漂洗1次,吹干，重悬于500ulTE中。

7、加入1ulRNaseA（10mg/mL），37℃处理1h。

8、用酚（pH80）:氯仿:异戊醇(25:24:1)和氯仿:异戊醇(24:1)各抽提1次。以4℃，10,000rpm，离心5min。

9、取上清，1/10V3MNaAc,25V体积的无水乙醇,-70℃沉淀30min以上。

10、沉淀用75%乙醇漂洗，风干,溶于200ulTE中，-20℃保存备用。

植物基因组提取(CATB法)

作者： 时间：2008-05-13 14:26:27 来源: 生物谷 浏览评论

一、实验目的

掌握植物总DNA的抽提方法和基本原理。学习根据不同的植物和实验要求设计和改良植物总DNA抽提方法。

二、实验原理

通常采用机械研磨的方法破碎植物的组织和细胞，由于植物细胞匀浆含有多种酶类(尤其是氧化酶类)对DNA的抽提产生不利的影响，在抽提缓冲液中需加入抗氧化剂或强还原剂(如巯基乙醇)以降低这些酶类的活性。在液氮中研磨，材料易于破碎，并减少研磨过程中各种酶类的作用。

十二烷基肌酸钠(sarkosyl)、十六烷基三甲基溴化铵(hexadyltrimethyl ammomum bromide，简称为CTAB)、十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate，简称SDS)等离子型表面活性剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使DNA得以游离出来。再加入苯酚和氯仿等有机溶剂，能使蛋白质变性，并使抽提液分相，因核酸(DNA、RNA)水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。上清液中加入无水乙醇使DNA沉淀，沉淀DNA溶于TE溶液中，即得植物总DNA溶液。

三、实验材料

水稻幼叶

四、主要配方

2% CTAB抽提缓冲溶液: CTAB 4g NaCl 16364 g 1M Tris-HCl 20ml( PH80) 05M EDTA 8ml，先用70ml ddH2O溶解, 再定容至200ml灭菌, 冷却后02-1% 2-巯基乙醇 （400ul） 氯仿-异戊醇（24：1）：先加96ml氯仿，再加4ml异戊醇，摇匀即可。

五、实验步骤

1 DNA的提取

（1） 2%CTAB抽提缓冲液在65℃水浴中预热。

（2）取少量叶片（约1g）置于研钵中，用液氮磨至粉状；

（3） 加入700ul的2%CTAB抽提缓冲液，轻轻搅动；

（4） 将磨碎液分倒入15 ml的灭菌中，磨碎液的高度约占管的三分之二；

（5）置于65℃的水浴槽或恒温箱中，每隔10 min轻轻摇动，40 min后取出；

（6）冷却2 min后，加入氯仿-异戊醇（24：1）至满管，剧烈振荡2~3 min，使两者混合均匀；

（7）放入离心机中10 000 rpm离心10 min，与此同时，将600 µl的异丙醇加入另一新的灭菌中；

（8） 10 000 rpm离心1 min后，移液器轻轻地吸取上清夜，转入含有异丙醇的内，将离心管慢慢上下摇动30 sec，使异丙醇与水层充分混合至能见到DNA絮状物；

（9）10000 rpm离心1 min后，立即倒掉液体，注意勿将白色DNA沉淀倒出，将离心管倒立于铺开的纸巾上； （10）60 sec后，直立离心管，加入720 µl的75%乙醇及80 µl 5 M的醋酸钠，轻轻转动，用手指弹管尖，使沉淀与管底的DNA块状物浮游于液体中；

（11）放置30 min，使DNA块状物的不纯物溶解；

（12）10000 rpm离心1 min后，倒掉液体，再加入800 µl 75%的乙醇，将DNA再洗 30 min；

（13）10000 rpm离心30 sec后，立即倒掉液体，将离心管倒立于铺开的纸巾上；数分钟后，直立离心管，干燥DNA（自然风干或用风筒吹干）；

（14）加入50 µl 05 × TE(含RNase)缓冲液，使DNA溶解，置于37℃恒温箱约15 h，使RNA消解；

（15）置于-20℃保存、备用。

2 DNA质量检测

琼脂糖电泳检测，原理和方法见实验二。

六、 注意事项

（1）叶片磨得越细越好。

（2）移液器的使用。

（3）由于植物细胞中含有大量的DNA酶，因此，除在抽提液中加入EDTA抑制酶的活性外，第一步的操作应迅速，以免组织解冻，导致细胞裂解，释放出DNA酶，使DNA降解。

提取基因组DNA和细胞核DNA是不同的方法

提取细胞核要先把细胞破碎分离出细胞核，要在甘油或其他保护剂中进行

SDS十二烷基磺酸钠：可破坏细胞膜、核膜，并使组织蛋白与DNA分离

CATB是一种抽提液，破坏细胞膜的~具体忘了~

DNA不溶于异丙醇，异丙醇可以析出DNA，产生白色絮状沉淀，用枪头挑出就可以了

以下是一些具体方法，希望有用

基因组DNA提取方法

制备基因组DNA是进行基因结构和功能研究的重要步骤，通常要求得到的片段的长度不小于100-200kb。在DNA提取过程中应尽量避免使DNA断裂和降解的各种因素，以保证DNA的完整性，为后续的实验打下基础。主要是CTAB方法，其他的方法还有1物理方式:玻璃珠法,超声波法,研磨法,冻融法。2化学方式：异硫氰酸胍法,碱裂解法3生物方式:酶法。根据核酸分离纯化方式的不同有:硅质材料、阴离子交换树脂等

试验步骤：

1、贴壁细胞用胰酶消化，离心收集。

2、细胞重悬于冰冷的PBS漂洗一次，离心收集。试验步骤2再重新作一边。

3、加入5mlDNA提取缓冲液，(10mmol/LTris-cl,01mol/LEDTA,o5%SDS),混匀。

4、加入25ul蛋白酶K,使终浓度达到100ug/ml,混匀，50℃水浴3h,

5、用等体积的酚抽提一次，2500rpm离心收集水相，用等体积的（酚，氯仿，异戊醇）混合物抽提一次，2500r/min离心收集水相

6、用等体积的氯仿，异戊醇抽提一次。加入等体积的5mol/L的LiCL,混匀，冰浴，10min。

7、2500rpm离心10min转上清于一离心管中。加入等体积的异丙醇。室温10min。

2500rpm,离心10min。弃上清。

8、加入01倍体积3mol/L乙酸钠(PH52)与2倍体积-20℃预冷无水乙醇。-20℃20min。

9、12000r/min,室温离心5min。弃上清。将DNA溶于适量TE中。

外周血DNA提取技术

分离外周血白细胞提取方法：

试验步骤：

1、取人肘静脉血5ml，EDTA抗凝，2500rpm离心10min。

2、小心吸取上层血浆，分装到3个05ml离心管中。

3、在血细胞中加入3倍体积的溶血液，摇匀，冰浴15min。

4、2500rpm离心10min，弃上清。

5、加入10ml溶血液，摇匀，冰浴15min。

6、3000rpm离心10min，弃上清。

7、倒置离心管，去掉残液。

8、得白细胞，－80C冻存。

试验要求：

血至分离白细胞之间隔时间在室温下放置不超过2h，4℃放置不超过5h，以防白细胞自溶。

氯仿法抽提外周血白细胞基因组DNA：

试验试剂：

Ligsisbuffer：

133mMNH4ClNHCl712g09mMNH4HCO3NH4HCO30071g01mMEDTA05mMEDTA02ml；最后加灭菌去离子水至1000ml，高压灭菌。

ACD抗凝剂：柠檬酸168g柠檬酸钠462g葡萄糖515g；最后加灭菌去离子水至350ml，高压灭菌。

提取缓冲液（Extractionbuffer）：

10mMTrisCl(PH=80)1MTrisCl(PH=80)1ml01mMEDTA(PH=80)05mMEDTA(PH=80)20ml05%SDS10%SDS05ml；最后加灭菌去离子水至100ml，高压灭菌

试验步骤：

1、在500μl抗凝血中加入ligsisbuffer1000μl，充分颠混至清亮。以4000rpm，离心5min。弃上清液。

2、沉淀中加入ligsisbuffer1500μl，充分匀浆。以6000rpm，离心5min。

3、彻底弃去上清，加入extractionbuffer500μl（裂解细胞），混匀置于37℃，水溶1h。

4、加入8μl的蛋白酶K，颠混，37℃过夜（或55℃，3h，但是37℃效果要好些）。

5、每管加入450μl饱和酚（取溶液下层）缓慢摇晃10min，以5500rpm，离心15min。

6、取上清，每管加入250μl饱和酚和250μl氯仿－异戊醇，摇匀10min，以5500rpm，离心15min。

7、取上清，每管加入500μl氯仿－异戊醇，摇匀10min，以5500rpm，离心15min。

8、取上清，每管加50μl的3M的NaAC＋，适量无水乙醇（预冷）至满，摇匀放入-20℃保存2h以上。

9、以12000rpm，离心20min。去上清，加入70％乙醇500μl，以12000rpm，离心5min，去上清，50－60℃干燥。

10、加入50μl灭菌去离子水，转弹，混匀。

NaI提取法提取外周血白细胞基因组：

实验步骤：

1、取外周抗凝血（全血）100ul于eppendorf管中，12000rpm离心12min。

2、弃上清，加双蒸水200ul溶解，摇匀20s。

3、混匀后加6MNaI溶液200ul，摇匀20s。

4、加入氯仿/异戊醇（24：1）400ul，边加边摇，摇匀20s，12000rpm离心12min。

5、取上层液350ul，加入另一新eppendorf管中，加06倍体积异丙醇，摇匀20s，室温放置15min，静置后的反应体系15000rpm离心12min，使沉淀紧贴eppendorf管壁。

6、弃异丙醇，加70％乙醇1ml（不振动），以15000rpm离心12min。

7、弃乙醇，敞开eppendorf管盖，烘干（37℃恒温箱）后，加1xTE溶液30ul，溶解DNA＞12h以上，制成的DNA液-20℃冰箱保存备用。

常用的外周血白细胞基因提取方法：

试验原理：

苯酚/氯仿提取DNA是利用酚是蛋白质的变性剂，反复抽提，使蛋白质变性，SDS(十二烷基磺酸钠)将细胞膜裂解，在蛋白酶K、EDTA的存在下消化蛋白质或多肽或小肽分子，核蛋白变性降解，使DNA从核蛋白中游离出来。DNA易溶于水，不溶于有机溶剂。蛋白质分子表面带有亲水基团，也容易进行水合作用，并在表面形成一层水化层，使蛋白质分子能顺利地进入到水溶液中形成稳定的胶体溶液。当有机溶液存在时，蛋白质的这种胶体稳定性遭到破坏，变性沉淀。离心后有机溶剂在试管底层(有机相)，DNA存在于上层水相中，蛋白质则沉淀于两相之间。酚-氯仿抽提的作用是除去未消化的蛋白质。氯仿的作用是有助于水相与有机相分离和除去DNA溶液中的酚。抽提后的DNA溶液用2倍体积的无水乙醇在1/103mol/LNaCl存在下沉淀DNA，回收DNA用70%乙醇洗去DNA沉淀中的盐，真空干燥，用TE缓冲液溶解DNA备用。

试验步骤：

1、将1mlEDTA抗凝贮冻血液于室温解冻后移入5ml离心管中，加入1ml磷酸缓冲盐溶液（PBS），混匀，3500rpm离心15min,倾去含裂解红细胞的上清。重复一次。用07mlDNA提取液混悬白细胞沉淀，37℃水浴温育1h。

2、将上述DNA提取液混悬白细胞，37℃水浴温育1h后，加入1mg/ml蛋白酶K02ml,至终浓度为100-200ug/ml,上下转动混匀，液体变粘稠。50℃水浴保温3h，裂解细胞，消化蛋白。保温过程中，应不时上下转动几次，混匀反应液。

3、反应液冷却至室温后，加入等体积的饱和酚溶液，温和地上下转动离心管5-10min，直至水相与酚相混匀成乳状液。5000rpm离心15min，用大口吸管小心吸取上层粘稠水相，移至另一离心管中。重复酚抽提一次。加等体积的氯仿：异戊醇（24：1），上下转动混匀，5000rpm离心15min，用大口吸管小心吸取上层粘稠水相，移至另一离心管中。重复一次。

4、加入1/5体积的3mol/LNaAc及2倍体积的预冷的无水乙醇，室温下慢慢摇动离心管，即有乳白色云絮状DNA出现。用玻璃棒小心挑取云絮状的DNA，转入另一15ml离心管中，加70%乙醇02ml，以5000rpm离心5min。洗涤DNA，弃上清，去除残留的盐。重复一次。室温挥发残留的乙醇，但不要让DNA完全干燥。加TE液20ul溶解DNA,置于摇床平台缓慢摇动，DNA完全溶解通常需12-24h。制成的DNA液-20℃冰箱保存备用。

真核细胞DNA的制备

一般真核细胞基因组DNA有107-9bp，可以从新鲜组织、培养细胞或低温保存的组织细胞中提取，常是采用在EDTA以及SDS等试剂存在下用蛋白酶K消化细胞，随后用酚抽提而实现的。这一方法获得的DNA不仅经酶切后可用于Southern分析，还可用于PCR的模板、文库构建等实验。

根据材料来源不同，采取不同的材料处理方法，而后的DNA提取方法大体类似，但都应考虑以下两个原则：

1、防止和抑制DNase对DNA的降解。

2、尽量减少对溶液中DNA的机械剪切破坏。

试剂准备：

1、TE:10mMTris-HCl(pH78);1mMEDTA(pH80)。

2、TBS:25mMTris-HCl(pH74);200mMNaCl;5mMKCl。

3、裂解缓冲液：250mMSDS;使用前加入蛋白酶K至100mg/ml。

4、20%SDS

5、2mg/ml蛋白酶K

6、Tris饱和酚（pH80）、酚/氯仿（酚∶氯仿=1∶1）、氯仿

7、无水乙醇、75%乙醇

试验步骤：

材料处理：

1、新鲜或冰冻组织处理：

1)取组织块03-05cm3,剪碎，加TE05ml，转移到匀浆器中匀浆。

2)将匀浆液转移到15ml离心管中。

3)加20%SDS25ml，蛋白酶K(2mg/ml)25ml，混匀。

4)60°C水浴1-3hr。

2、培养细胞处理：

1)将培养细胞悬浮后，用TBS洗涤一次。

2)离心4000g×5min，去除上清液。

3)加10倍体积的裂解缓冲液。

4)50-55°C水浴1-2hr。

DNA提取：

1、加等体积饱和酚至上述样品处理液中，温和、充分混匀3min。

2、离心5000g×10min，取上层水相到另一15ml离心管中。

3、加等体积饱和酚，混匀，离心5000g×10min，取上层水相到另一管中。

4、加等体积酚/氯仿，轻轻混匀，离心5000g×10min，取上层水相到另一管中。如水相仍不澄清，可重复此步骤数次。

5、加等体积氯仿，轻轻混匀，离心5000g×10min，取上层水相到另一管中。

6、加1/10体积的3M醋酸钠（pH52）和25倍体积的无水乙醇，轻轻倒置混匀。

7、待絮状物出现后，离心5000g×5min，弃上清液。

8、沉淀用75%乙醇洗涤，离心5000g×3min，弃上清液。

9、室温下挥发乙醇，待沉淀将近透明后加50-100mlTE溶解过夜。

植物组织中DNA的提取

试验原理：

脱氧核糖核酸（deoxribonucleicacid，DNA）是一切生物细胞的重要组成成分，主要存在于细胞核中，盐溶法是提取DNA的常规技术之一。从细胞中分离得到的DNA是与蛋白质结合的DNA，其中还含有大量RNA，即核糖核蛋白。如何有效地将这两种核蛋白分开是技术的关键。DNA不溶于014mol/L的NaCl溶液中，而RNA则能溶于014mol/L的NaCl溶液之中，利用这一性质就可以将二者从破碎细胞浆液中分开。制备过程中，细胞破碎的同时就有Dnase释放到提取液中，使DNA因被降解而影响得率，在提取缓冲液中加入适量的柠檬酸盐和EDTA，既可抑制酶的活性又可使蛋白质变性而与核酸分离，再加入阴离子去垢剂015％的SDS，经过2h搅拌，或用氯仿－异醇除去蛋白，通过离心使蛋白质沉淀而除去，得到的是含有核酸的上清液。然后用95％的预冷乙醇即可把DNA从除去蛋白质的提取液中沉淀出来。

植物DNA的SDS提取法：

试验试剂：

1、研磨缓冲液：称取5963gNaCl，1325g柠檬酸三钠，372gEDTA－Na分别溶解后合并为一，用02mol/L的NaOH调至pH70，并定容至1000ml。

2、10×SSC溶液：称取8766gNaCl和4412g柠檬酸三钠，分别溶解，一起定容至1000ml。

3、1×SSC溶液：用10×SSC溶液稀释10倍。

4、01×SSC溶液：用1×SSC溶液稀释10倍。

5、Rnase溶液：用014mol/LNaCl溶液配制成25mg/ml的酶液，用1mol/LHCl，pH至50，使用前经80℃水浴处理5min（以破坏可能存在的Dnase）。

6、氯仿－异戊醇：按24ml氯仿和1ml异戊醇混合。

7、5mol/L高氯酸钠溶液：称取NaClO4．H2O7023g，先加入少量蒸馏水溶解再容至100ml。

8、SDS（十二烷基硫酸钠）化学试剂的重结晶：将SDS放入无水酒精中达到饱和为止，然后在70～80℃的水浴中溶解，趁热过滤，冷却之后即将滤液放入冰箱，待结晶出现再置室温下凉干待用。

9、1mol／LHCl。

10、02mol/LNaOH。

11、二苯胺乙醛试剂：15g二苯胺溶于100ml冰醋酸中，添加15ml浓硫酸，装入棕色瓶，贮存暗处，使用时加01ml乙醛液〔浓乙醛：H2O＝1：50（V／V）〕。

12、10mol/L高酸溶液（HClO4）。

13、005mol/LNaOH。

14、DNA标准液：取标准DNA25mg溶于少量005molL-1NaOH中，再用005mol/LNaOH定容至25ml，后用移溶管吸取此液5ml至50ml容量瓶中，加50ml1mol/LHClO4，混合冷却后用05mol/LHClO4定容至刻度，则得100μg/ml的标准溶液。

实验步骤：

1、称取植物幼嫩组织10g剪碎置研钵中，加10ml预冷研磨缓冲液并加入01g左右的SDS，置冰浴上研磨成糊状。

2、将匀浆无损转入25ml刻度试管中加入等体积的氯仿－异戊醇混合液，加上塞子，剧烈振荡30s，转入离心管，静置片刻以脱除组织蛋白质。以4000rpm离心5min。

3、离心形成三层，小心地吸取上层清液至刻度试管中，弃去中间层的细胞碎片、变性蛋白质及下层的氯仿。

4、将试管置72℃水浴中保温3min（不超过4min），以灭活组织的DNA酶，然后迅速取出试管置冰水浴中冷却到室温，加5mol/L高氯酸钠溶液〔提取液：高氯酸钠溶液＝4：1（V／V）〕，使溶液中高氯酸钠的最终浓度为1mol/L。

5、再次加入等体积氯仿－异戊醇混合液至大试管中，振荡1min，静置后在室温下离心（4000rpm）5min，取上清液置小烧杯中。

6、用滴管吸95％的预冷乙醇，慢慢地加入烧杯中上清液的表面上，直至乙醇的体积为上清液的两倍，用玻璃棒轻轻搅动。此时核酸迅速以纤维状沉淀缠绕在玻璃棒上。

7、然后加入05ml左右的10×SSC，使最终浓度为1×SSC。

8、重复第6步骤和第7步骤即得到DNA的粗制品。

9、加入已处理的Rnase溶液，使其最后的作用浓度为50～70μg/ml，并在37℃水浴中保温30min，以除去RNA。

10、加入等体积的氯仿－异戊醇混合液，在三角瓶中振荡1min，再除去残留蛋白质及所加Rnase蛋白，室温下以4000rpm离心5min，收集上层水溶液。

11、再按6、7步骤处理即可得到纯化的DNA液。

植物DNA的CTAB提取法：

试验步骤：

1、称取新鲜叶片2-3g，剪碎放入研钵中，在液氮中研磨成粉末。

2、将粉末转移到加有7ml经预热的15×CTAB提取缓冲液15ml离心管中，迅速混匀后置于65℃水浴中，温育30min。

3、取出离心管,冷却至室温，加入氯仿/异戊醇(24:1)，充分混匀，室温下2300转离心20min。

4、将上清转移至另一新的15ml离心管中，加入1/10体积10%的CTAB和等体积的氯仿/异戊醇。充分混匀，2300rpm离心20min。

5、转移上清至另一新的15ml离心管中，加入等体积1%的CTAB沉淀缓冲液，轻轻摇晃至形成DNA絮状沉淀。1000rpm离心10min，使DNA沉淀于管底。

6、加入15-2ml的1mol/LNaCl及5μlRNase置于56℃水浴中过夜。

7、待DNA完全溶解后，加2-3ml4℃预冷的95%的冰乙醇使DNA沉淀，挑出DNA，置于15ml离心管中，用70%乙醇清洗30min。

8、离心机甩5s，倒出70%乙醇，再用95%乙醇浸泡5min，倒出95%乙醇，在超净工作台上吹干。

9、将风干的DNA直接在4℃保存备用或溶于100μlTE溶液中于-20℃保存。

细菌DNA的提取方法

针对一些不易于提取的细菌的方法:

试验试剂：

抽提缓冲液：2%CTAB(W/V)2%PVPK25(w/v)（去色素）100mMTris-HCl(pH80)

25mMEDTA(pH80)20MNaCl

10MLiCl

2MLiCl

DEPC-water（抑制RNA酶活性）

3MNaAc(pH52)

96%乙醇

70%乙醇

试验步骤：

1、抽提缓冲液65℃预热。

2、加菌体到已经预热的缓冲液（700ul）中混匀，65℃，10min。

3、加酚/氯仿/异戊醇（25：24：1），振荡，以12,000rpm，离心10min。

4、取上清，加氯仿/异戊醇（24：1）振荡，以12,000rpm，离心10min。

5、重复再作一次步骤4。

6、加入1/10体积的3M醋酸钠和15倍体积的乙醇（或加入等体积的异丙醇），－20C下沉淀。

7、以2,000rpm，离心10min。

8、弃上清，以70％乙醇条洗沉淀，也可以再用100％乙醇洗，然后溶解于100ml水中。

较为常用的细菌DNA提取方法：

实验步骤：

1、将菌株接种于液体LB培养基，37℃震荡培养过夜。

2、取15ml培养物12000rpm离心2min。

3、沉淀中加入567ul的TE缓冲液，反复吹打使之重新悬浮，加入30ul10%SDS和15ul的蛋白酶K，混匀，于37℃温育1h

4、加入100ul5mol/LNaCl,充分混匀，再加入80ulCTAB/NaCl溶液，混匀后再65℃温育10min。

5、加入等体积的酚/氯仿/异戊醇混匀，离心4-5min,将上清转入一只新管中，加入06-08倍体积的异丙醇，轻轻混合直到DNA沉淀下来，沉淀可稍加离心。

6、沉淀用1ml的70%乙醇洗涤后，离心弃乙醇．

真菌DNA提取总结的两种方法：

第一种方法：

试验步骤：

1、取真菌菌丝05g,在液氮中迅速研磨成粉。

2、加入4mL提取液，快速振荡混匀。

3、加入等体积的4mL的氯仿:异戊醇(24:1)，涡旋3～5min（此处是粗提没有加酚）。

4、以4℃，1000rpm，离心5min。

5、上清再用等体积的氯仿:异戊醇(24:1)抽提一次。以4℃，10,000rpm，离心5min。

6、取上清，加入2/3倍体积的-20℃预冷的异丙醇或25倍体积的无水乙醇沉淀,混匀,静置约30min。

7、用毛细玻棒挑出絮状沉淀,用75%乙醇反复漂洗数次,再用无水乙醇漂洗1次,吹干，重悬于500ulTE中。

8、加入1ulRNaseA（10mg/mL），37℃下处理1h。

9、用酚（pH80）:氯仿:异戊醇(25:24:1)和氯仿:异戊醇(24:1)各抽提1次。以4℃，10,000rpm，离心5min。

10、取上清，加入1/10倍体积的3MNaAc,25倍体积的无水乙醇,-70℃沉淀30min以上。

11、沉淀用75%乙醇漂洗，风干,溶于200ulTE中，-20℃保存备用。

DNA提取液：02MTris-HCl（pH75），05MNaCl，001MEDTA，1％SDS，3MNaAc。

第二种方法：

试验步骤：

1、真菌菌丝05-1g,在液氮中迅速研磨成粉。

2、加入3mL65℃预热的DNA提取缓冲液，快速振荡混匀65℃水浴30min,期间混匀2-3次。

3、加入1mL5MKAc，冰浴20min。

4、等体积的氯仿:异戊醇(24:1)抽提1次（10,000rpm，4℃离心5min）。

5、取上清，加入2/3倍体积的-20℃预冷异丙醇,混匀,静置约30min。

6、用毛细玻棒挑出絮状沉淀,用75%乙醇反复漂洗数次,再用无水乙醇漂洗1次,吹干，重悬于500ulTE中。

7、加入1ulRNaseA（10mg/mL），37℃处理1h。

8、用酚（pH80）:氯仿:异戊醇(25:24:1)和氯仿:异戊醇(24:1)各抽提1次。以4℃，10,000rpm，离心5min。

9、取上清，1/10V3MNaAc,25V体积的无水乙醇,-70℃沉淀30min以上。

10、沉淀用75%乙醇漂洗，风干,溶于200ulTE中，-20℃保存备用。

植物基因组提取(CATB法)

作者： 时间：2008-05-13 14:26:27 来源: 生物谷 浏览评论

一、实验目的

掌握植物总DNA的抽提方法和基本原理。学习根据不同的植物和实验要求设计和改良植物总DNA抽提方法。

二、实验原理

通常采用机械研磨的方法破碎植物的组织和细胞，由于植物细胞匀浆含有多种酶类(尤其是氧化酶类)对DNA的抽提产生不利的影响，在抽提缓冲液中需加入抗氧化剂或强还原剂(如巯基乙醇)以降低这些酶类的活性。在液氮中研磨，材料易于破碎，并减少研磨过程中各种酶类的作用。

十二烷基肌酸钠(sarkosyl)、十六烷基三甲基溴化铵(hexadyltrimethyl ammomum bromide，简称为CTAB)、十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate，简称SDS)等离子型表面活性剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使DNA得以游离出来。再加入苯酚和氯仿等有机溶剂，能使蛋白质变性，并使抽提液分相，因核酸(DNA、RNA)水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。上清液中加入无水乙醇使DNA沉淀，沉淀DNA溶于TE溶液中，即得植物总DNA溶液。

三、实验材料

水稻幼叶

四、主要配方

2% CTAB抽提缓冲溶液: CTAB 4g NaCl 16364 g 1M Tris-HCl 20ml( PH80) 05M EDTA 8ml，先用70ml ddH2O溶解, 再定容至200ml灭菌, 冷却后02-1% 2-巯基乙醇 （400ul） 氯仿-异戊醇（24：1）：先加96ml氯仿，再加4ml异戊醇，摇匀即可。

五、实验步骤

1 DNA的提取

（1） 2%CTAB抽提缓冲液在65℃水浴中预热。

（2）取少量叶片（约1g）置于研钵中，用液氮磨至粉状；

（3） 加入700ul的2%CTAB抽提缓冲液，轻轻搅动；

（4） 将磨碎液分倒入15 ml的灭菌中，磨碎液的高度约占管的三分之二；

（5）置于65℃的水浴槽或恒温箱中，每隔10 min轻轻摇动，40 min后取出；

（6）冷却2 min后，加入氯仿-异戊醇（24：1）至满管，剧烈振荡2~3 min，使两者混合均匀；

（7）放入离心机中10 000 rpm离心10 min，与此同时，将600 µl的异丙醇加入另一新的灭菌中；

（8） 10 000 rpm离心1 min后，移液器轻轻地吸取上清夜，转入含有异丙醇的内，将离心管慢慢上下摇动30 sec，使异丙醇与水层充分混合至能见到DNA絮状物；

（9）10000 rpm离心1 min后，立即倒掉液体，注意勿将白色DNA沉淀倒出，将离心管倒立于铺开的纸巾上； （10）60 sec后，直立离心管，加入720 µl的75%乙醇及80 µl 5 M的醋酸钠，轻轻转动，用手指弹管尖，使沉淀与管底的DNA块状物浮游于液体中；

（11）放置30 min，使DNA块状物的不纯物溶解；

（12）10000 rpm离心1 min后，倒掉液体，再加入800 µl 75%的乙醇，将DNA再洗 30 min；

（13）10000 rpm离心30 sec后，立即倒掉液体，将离心管倒立于铺开的纸巾上；数分钟后，直立离心管，干燥DNA（自然风干或用风筒吹干）；

（14）加入50 µl 05 × TE(含RNase)缓冲液，使DNA溶解，置于37℃恒温箱约15 h，使RNA消解；

（15）置于-20℃保存、备用。

2 DNA质量检测

琼脂糖电泳检测，原理和方法见实验二。

六、 注意事项

（1）叶片磨得越细越好。

（2）移液器的使用。

（3）由于植物细胞中含有大量的DNA酶，因此，除在抽提液中加入EDTA抑制酶的活性外，第一步的操作应迅速，以免组织解冻，导致细胞裂解，释放出DNA酶，使DNA降解。

提取基因组DNA和细胞核DNA是不同的方法

提取细胞核要先把细胞破碎分离出细胞核，要在甘油或其他保护剂中进行

SDS十二烷基磺酸钠：可破坏细胞膜、核膜，并使组织蛋白与DNA分离

CATB是一种抽提液，破坏细胞膜的~具体忘了~

DNA不溶于异丙醇，异丙醇可以析出DNA，产生白色絮状沉淀，用枪头挑出就可以了

以下是一些具体方法，希望有用

基因组DNA提取方法

制备基因组DNA是进行基因结构和功能研究的重要步骤，通常要求得到的片段的长度不小于100-200kb。在DNA提取过程中应尽量避免使DNA断裂和降解的各种因素，以保证DNA的完整性，为后续的实验打下基础。主要是CTAB方法，其他的方法还有1物理方式:玻璃珠法,超声波法,研磨法,冻融法。2化学方式：异硫氰酸胍法,碱裂解法3生物方式:酶法。根据核酸分离纯化方式的不同有:硅质材料、阴离子交换树脂等

试验步骤：

1、贴壁细胞用胰酶消化，离心收集。

2、细胞重悬于冰冷的PBS漂洗一次，离心收集。试验步骤2再重新作一边。

3、加入5mlDNA提取缓冲液，(10mmol/LTris-cl,01mol/LEDTA,o5%SDS),混匀。

4、加入25ul蛋白酶K,使终浓度达到100ug/ml,混匀，50℃水浴3h,

5、用等体积的酚抽提一次，2500rpm离心收集水相，用等体积的（酚，氯仿，异戊醇）混合物抽提一次，2500r/min离心收集水相

6、用等体积的氯仿，异戊醇抽提一次。加入等体积的5mol/L的LiCL,混匀，冰浴，10min。

7、2500rpm离心10min转上清于一离心管中。加入等体积的异丙醇。室温10min。

2500rpm,离心10min。弃上清。

8、加入01倍体积3mol/L乙酸钠(PH52)与2倍体积-20℃预冷无水乙醇。-20℃20min。

9、12000r/min,室温离心5min。弃上清。将DNA溶于适量TE中。

外周血DNA提取技术

分离外周血白细胞提取方法：

试验步骤：

1、取人肘静脉血5ml，EDTA抗凝，2500rpm离心10min。

2、小心吸取上层血浆，分装到3个05ml离心管中。

3、在血细胞中加入3倍体积的溶血液，摇匀，冰浴15min。

4、2500rpm离心10min，弃上清。

5、加入10ml溶血液，摇匀，冰浴15min。

6、3000rpm离心10min，弃上清。

7、倒置离心管，去掉残液。

8、得白细胞，－80C冻存。

试验要求：

血至分离白细胞之间隔时间在室温下放置不超过2h，4℃放置不超过5h，以防白细胞自溶。

氯仿法抽提外周血白细胞基因组DNA：

试验试剂：

Ligsisbuffer：

133mMNH4ClNHCl712g09mMNH4HCO3NH4HCO30071g01mMEDTA05mMEDTA02ml；最后加灭菌去离子水至1000ml，高压灭菌。

ACD抗凝剂：柠檬酸168g柠檬酸钠462g葡萄糖515g；最后加灭菌去离子水至350ml，高压灭菌。

提取缓冲液（Extractionbuffer）：

10mMTrisCl(PH=80)1MTrisCl(PH=80)1ml01mMEDTA(PH=80)05mMEDTA(PH=80)20ml05%SDS10%SDS05ml；最后加灭菌去离子水至100ml，高压灭菌

试验步骤：

1、在500μl抗凝血中加入ligsisbuffer1000μl，充分颠混至清亮。以4000rpm，离心5min。弃上清液。

2、沉淀中加入ligsisbuffer1500μl，充分匀浆。以6000rpm，离心5min。

3、彻底弃去上清，加入extractionbuffer500μl（裂解细胞），混匀置于37℃，水溶1h。

4、加入8μl的蛋白酶K，颠混，37℃过夜（或55℃，3h，但是37℃效果要好些）。

5、每管加入450μl饱和酚（取溶液下层）缓慢摇晃10min，以5500rpm，离心15min。

6、取上清，每管加入250μl饱和酚和250μl氯仿－异戊醇，摇匀10min，以5500rpm，离心15min。

7、取上清，每管加入500μl氯仿－异戊醇，摇匀10min，以5500rpm，离心15min。

8、取上清，每管加50μl的3M的NaAC＋，适量无水乙醇（预冷）至满，摇匀放入-20℃保存2h以上。

9、以12000rpm，离心20min。去上清，加入70％乙醇500μl，以12000rpm，离心5min，去上清，50－60℃干燥。

10、加入50μl灭菌去离子水，转弹，混匀。

NaI提取法提取外周血白细胞基因组：

实验步骤：

1、取外周抗凝血（全血）100ul于eppendorf管中，12000rpm离心12min。

2、弃上清，加双蒸水200ul溶解，摇匀20s。

3、混匀后加6MNaI溶液200ul，摇匀20s。

4、加入氯仿/异戊醇（24：1）400ul，边加边摇，摇匀20s，12000rpm离心12min。

5、取上层液350ul，加入另一新eppendorf管中，加06倍体积异丙醇，摇匀20s，室温放置15min，静置后的反应体系15000rpm离心12min，使沉淀紧贴eppendorf管壁。

6、弃异丙醇，加70％乙醇1ml（不振动），以15000rpm离心12min。

7、弃乙醇，敞开eppendorf管盖，烘干（37℃恒温箱）后，加1xTE溶液30ul，溶解DNA＞12h以上，制成的DNA液-20℃冰箱保存备用。

常用的外周血白细胞基因提取方法：

试验原理：

苯酚/氯仿提取DNA是利用酚是蛋白质的变性剂，反复抽提，使蛋白质变性，SDS(十二烷基磺酸钠)将细胞膜裂解，在蛋白酶K、EDTA的存在下消化蛋白质或多肽或小肽分子，核蛋白变性降解，使DNA从核蛋白中游离出来。DNA易溶于水，不溶于有机溶剂。蛋白质分子表面带有亲水基团，也容易进行水合作用，并在表面形成一层水化层，使蛋白质分子能顺利地进入到水溶液中形成稳定的胶体溶液。当有机溶液存在时，蛋白质的这种胶体稳定性遭到破坏，变性沉淀。离心后有机溶剂在试管底层(有机相)，DNA存在于上层水相中，蛋白质则沉淀于两相之间。酚-氯仿抽提的作用是除去未消化的蛋白质。氯仿的作用是有助于水相与有机相分离和除去DNA溶液中的酚。抽提后的DNA溶液用2倍体积的无水乙醇在1/103mol/LNaCl存在下沉淀DNA，回收DNA用70%乙醇洗去DNA沉淀中的盐，真空干燥，用TE缓冲液溶解DNA备用。

试验步骤：

1、将1mlEDTA抗凝贮冻血液于室温解冻后移入5ml离心管中，加入1ml磷酸缓冲盐溶液（PBS），混匀，3500rpm离心15min,倾去含裂解红细胞的上清。重复一次。用07mlDNA提取液混悬白细胞沉淀，37℃水浴温育1h。

2、将上述DNA提取液混悬白细胞，37℃水浴温育1h后，加入1mg/ml蛋白酶K02ml,至终浓度为100-200ug/ml,上下转动混匀，液体变粘稠。50℃水浴保温3h，裂解细胞，消化蛋白。保温过程中，应不时上下转动几次，混匀反应液。

3、反应液冷却至室温后，加入等体积的饱和酚溶液，温和地上下转动离心管5-10min，直至水相与酚相混匀成乳状液。5000rpm离心15min，用大口吸管小心吸取上层粘稠水相，移至另一离心管中。重复酚抽提一次。加等体积的氯仿：异戊醇（24：1），上下转动混匀，5000rpm离心15min，用大口吸管小心吸取上层粘稠水相，移至另一离心管中。重复一次。

4、加入1/5体积的3mol/LNaAc及2倍体积的预冷的无水乙醇，室温下慢慢摇动离心管，即有乳白色云絮状DNA出现。用玻璃棒小心挑取云絮状的DNA，转入另一15ml离心管中，加70%乙醇02ml，以5000rpm离心5min。洗涤DNA，弃上清，去除残留的盐。重复一次。室温挥发残留的乙醇，但不要让DNA完全干燥。加TE液20ul溶解DNA,置于摇床平台缓慢摇动，DNA完全溶解通常需12-24h。制成的DNA液-20℃冰箱保存备用。

真核细胞DNA的制备

一般真核细胞基因组DNA有107-9bp，可以从新鲜组织、培养细胞或低温保存的组织细胞中提取，常是采用在EDTA以及SDS等试剂存在下用蛋白酶K消化细胞，随后用酚抽提而实现的。这一方法获得的DNA不仅经酶切后可用于Southern分析，还可用于PCR的模板、文库构建等实验。

根据材料来源不同，采取不同的材料处理方法，而后的DNA提取方法大体类似，但都应考虑以下两个原则：

1、防止和抑制DNase对DNA的降解。

2、尽量减少对溶液中DNA的机械剪切破坏。

试剂准备：

1、TE:10mMTris-HCl(pH78);1mMEDTA(pH80)。

2、TBS:25mMTris-HCl(pH74);200mMNaCl;5mMKCl。

3、裂解缓冲液：250mMSDS;使用前加入蛋白酶K至100mg/ml。

4、20%SDS

5、2mg/ml蛋白酶K

6、Tris饱和酚（pH80）、酚/氯仿（酚∶氯仿=1∶1）、氯仿

7、无水乙醇、75%乙醇

试验步骤：

材料处理：

1、新鲜或冰冻组织处理：

1)取组织块03-05cm3,剪碎，加TE05ml，转移到匀浆器中匀浆。

2)将匀浆液转移到15ml离心管中。

3)加20%SDS25ml，蛋白酶K(2mg/ml)25ml，混匀。

4)60°C水浴1-3hr。

2、培养细胞处理：

1)将培养细胞悬浮后，用TBS洗涤一次。

2)离心4000g×5min，去除上清液。

3)加10倍体积的裂解缓冲液。

4)50-55°C水浴1-2hr。

DNA提取：

1、加等体积饱和酚至上述样品处理液中，温和、充分混匀3min。

2、离心5000g×10min，取上层水相到另一15ml离心管中。

3、加等体积饱和酚，混匀，离心5000g×10min，取上层水相到另一管中。

4、加等体积酚/氯仿，轻轻混匀，离心5000g×10min，取上层水相到另一管中。如水相仍不澄清，可重复此步骤数次。

5、加等体积氯仿，轻轻混匀，离心5000g×10min，取上层水相到另一管中。

6、加1/10体积的3M醋酸钠（pH52）和25倍体积的无水乙醇，轻轻倒置混匀。

7、待絮状物出现后，离心5000g×5min，弃上清液。

8、沉淀用75%乙醇洗涤，离心5000g×3min，弃上清液。

9、室温下挥发乙醇，待沉淀将近透明后加50-100mlTE溶解过夜。

植物组织中DNA的提取

试验原理：

脱氧核糖核酸（deoxribonucleicacid，DNA）是一切生物细胞的重要组成成分，主要存在于细胞核中，盐溶法是提取DNA的常规技术之一。从细胞中分离得到的DNA是与蛋白质结合的DNA，其中还含有大量RNA，即核糖核蛋白。如何有效地将这两种核蛋白分开是技术的关键。DNA不溶于014mol/L的NaCl溶液中，而RNA则能溶于014mol/L的NaCl溶液之中，利用这一性质就可以将二者从破碎细胞浆液中分开。制备过程中，细胞破碎的同时就有Dnase释放到提取液中，使DNA因被降解而影响得率，在提取缓冲液中加入适量的柠檬酸盐和EDTA，既可抑制酶的活性又可使蛋白质变性而与核酸分离，再加入阴离子去垢剂015％的SDS，经过2h搅拌，或用氯仿－异醇除去蛋白，通过离心使蛋白质沉淀而除去，得到的是含有核酸的上清液。然后用95％的预冷乙醇即可把DNA从除去蛋白质的提取液中沉淀出来。

植物DNA的SDS提取法：

试验试剂：

1、研磨缓冲液：称取5963gNaCl，1325g柠檬酸三钠，372gEDTA－Na分别溶解后合并为一，用02mol/L的NaOH调至pH70，并定容至1000ml。

2、10×SSC溶液：称取8766gNaCl和4412g柠檬酸三钠，分别溶解，一起定容至1000ml。

3、1×SSC溶液：用10×SSC溶液稀释10倍。

4、01×SSC溶液：用1×SSC溶液稀释10倍。

5、Rnase溶液：用014mol/LNaCl溶液配制成25mg/ml的酶液，用1mol/LHCl，pH至50，使用前经80℃水浴处理5min（以破坏可能存在的Dnase）。

6、氯仿－异戊醇：按24ml氯仿和1ml异戊醇混合。

7、5mol/L高氯酸钠溶液：称取NaClO4．H2O7023g，先加入少量蒸馏水溶解再容至100ml。

8、SDS（十二烷基硫酸钠）化学试剂的重结晶：将SDS放入无水酒精中达到饱和为止，然后在70～80℃的水浴中溶解，趁热过滤，冷却之后即将滤液放入冰箱，待结晶出现再置室温下凉干待用。

9、1mol／LHCl。

10、02mol/LNaOH。

11、二苯胺乙醛试剂：15g二苯胺溶于100ml冰醋酸中，添加15ml浓硫酸，装入棕色瓶，贮存暗处，使用时加01ml乙醛液〔浓乙醛：H2O＝1：50（V／V）〕。

12、10mol/L高酸溶液（HClO4）。

13、005mol/LNaOH。

14、DNA标准液：取标准DNA25mg溶于少量005molL-1NaOH中，再用005mol/LNaOH定容至25ml，后用移溶管吸取此液5ml至50ml容量瓶中，加50ml1mol/LHClO4，混合冷却后用05mol/LHClO4定容至刻度，则得100μg/ml的标准溶液。

实验步骤：

1、称取植物幼嫩组织10g剪碎置研钵中，加10ml预冷研磨缓冲液并加入01g左右的SDS，置冰浴上研磨成糊状。

2、将匀浆无损转入25ml刻度试管中加入等体积的氯仿－异戊醇混合液，加上塞子，剧烈振荡30s，转入离心管，静置片刻以脱除组织蛋白质。以4000rpm离心5min。

3、离心形成三层，小心地吸取上层清液至刻度试管中，弃去中间层的细胞碎片、变性蛋白质及下层的氯仿。

4、将试管置72℃水浴中保温3min（不超过4min），以灭活组织的DNA酶，然后迅速取出试管置冰水浴中冷却到室温，加5mol/L高氯酸钠溶液〔提取液：高氯酸钠溶液＝4：1（V／V）〕，使溶液中高氯酸钠的最终浓度为1mol/L。

5、再次加入等体积氯仿－异戊醇混合液至大试管中，振荡1min，静置后在室温下离心（4000rpm）5min，取上清液置小烧杯中。

6、用滴管吸95％的预冷乙醇，慢慢地加入烧杯中上清液的表面上，直至乙醇的体积为上清液的两倍，用玻璃棒轻轻搅动。此时核酸迅速以纤维状沉淀缠绕在玻璃棒上。

7、然后加入05ml左右的10×SSC，使最终浓度为1×SSC。

8、重复第6步骤和第7步骤即得到DNA的粗制品。

9、加入已处理的Rnase溶液，使其最后的作用浓度为50～70μg/ml，并在37℃水浴中保温30min，以除去RNA。

10、加入等体积的氯仿－异戊醇混合液，在三角瓶中振荡1min，再除去残留蛋白质及所加Rnase蛋白，室温下以4000rpm离心5min，收集上层水溶液。

11、再按6、7步骤处理即可得到纯化的DNA液。

植物DNA的CTAB提取法：

试验步骤：

1、称取新鲜叶片2-3g，剪碎放入研钵中，在液氮中研磨成粉末。

2、将粉末转移到加有7ml经预热的15×CTAB提取缓冲液15ml离心管中，迅速混匀后置于65℃水浴中，温育30min。

3、取出离心管,冷却至室温，加入氯仿/异戊醇(24:1)，充分混匀，室温下2300转离心20min。

4、将上清转移至另一新的15ml离心管中，加入1/10体积10%的CTAB和等体积的氯仿/异戊醇。充分混匀，2300rpm离心20min。

5、转移上清至另一新的15ml离心管中，加入等体积1%的CTAB沉淀缓冲液，轻轻摇晃至形成DNA絮状沉淀。1000rpm离心10min，使DNA沉淀于管底。

6、加入15-2ml的1mol/LNaCl及5μlRNase置于56℃水浴中过夜。

7、待DNA完全溶解后，加2-3ml4℃预冷的95%的冰乙醇使DNA沉淀，挑出DNA，置于15ml离心管中，用70%乙醇清洗30min。

8、离心机甩5s，倒出70%乙醇，再用95%乙醇浸泡5min，倒出95%乙醇，在超净工作台上吹干。

9、将风干的DNA直接在4℃保存备用或溶于100μlTE溶液中于-20℃保存。

细菌DNA的提取方法

针对一些不易于提取的细菌的方法:

试验试剂：

抽提缓冲液：2%CTAB(W/V)2%PVPK25(w/v)（去色素）100mMTris-HCl(pH80)

25mMEDTA(pH80)20MNaCl

10MLiCl

2MLiCl

DEPC-water（抑制RNA酶活性）

3MNaAc(pH52)

96%乙醇

70%乙醇

试验步骤：

1、抽提缓冲液65℃预热。

2、加菌体到已经预热的缓冲液（700ul）中混匀，65℃，10min。

3、加酚/氯仿/异戊醇（25：24：1），振荡，以12,000rpm，离心10min。

4、取上清，加氯仿/异戊醇（24：1）振荡，以12,000rpm，离心10min。

5、重复再作一次步骤4。

6、加入1/10体积的3M醋酸钠和15倍体积的乙醇（或加入等体积的异丙醇），－20C下沉淀。

7、以2,000rpm，离心10min。

8、弃上清，以70％乙醇条洗沉淀，也可以再用100％乙醇洗，然后溶解于100ml水中。

较为常用的细菌DNA提取方法：

实验步骤：

1、将菌株接种于液体LB培养基，37℃震荡培养过夜。

2、取15ml培养物12000rpm离心2min。

3、沉淀中加入567ul的TE缓冲液，反复吹打使之重新悬浮，加入30ul10%SDS和15ul的蛋白酶K，混匀，于37℃温育1h

4、加入100ul5mol/LNaCl,充分混匀，再加入80ulCTAB/NaCl溶液，混匀后再65℃温育10min。

5、加入等体积的酚/氯仿/异戊醇混匀，离心4-5min,将上清转入一只新管中，加入06-08倍体积的异丙醇，轻轻混合直到DNA沉淀下来，沉淀可稍加离心。

6、沉淀用1ml的70%乙醇洗涤后，离心弃乙醇．

真菌DNA提取总结的两种方法：

第一种方法：

试验步骤：

1、取真菌菌丝05g,在液氮中迅速研磨成粉。

2、加入4mL提取液，快速振荡混匀。

3、加入等体积的4mL的氯仿:异戊醇(24:1)，涡旋3～5min（此处是粗提没有加酚）。

4、以4℃，1000rpm，离心5min。

5、上清再用等体积的氯仿:异戊醇(24:1)抽提一次。以4℃，10,000rpm，离心5min。

6、取上清，加入2/3倍体积的-20℃预冷的异丙醇或25倍体积的无水乙醇沉淀,混匀,静置约30min。

7、用毛细玻棒挑出絮状沉淀,用75%乙醇反复漂洗数次,再用无水乙醇漂洗1次,吹干，重悬于500ulTE中。

8、加入1ulRNaseA（10mg/mL），37℃下处理1h。

9、用酚（pH80）:氯仿:异戊醇(25:24:1)和氯仿:异戊醇(24:1)各抽提1次。以4℃，10,000rpm，离心5min。

10、取上清，加入1/10倍体积的3MNaAc,25倍体积的无水乙醇,-70℃沉淀30min以上。

11、沉淀用75%乙醇漂洗，风干,溶于200ulTE中，-20℃保存备用。

DNA提取液：02MTris-HCl（pH75），05MNaCl，001MEDTA，1％SDS，3MNaAc。

第二种方法：

试验步骤：

1、真菌菌丝05-1g,在液氮中迅速研磨成粉。

2、加入3mL65℃预热的DNA提取缓冲液，快速振荡混匀65℃水浴30min,期间混匀2-3次。

3、加入1mL5MKAc，冰浴20min。

4、等体积的氯仿:异戊醇(24:1)抽提1次（10,000rpm，4℃离心5min）。

5、取上清，加入2/3倍体积的-20℃预冷异丙醇,混匀,静置约30min。

6、用毛细玻棒挑出絮状沉淀,用75%乙醇反复漂洗数次,再用无水乙醇漂洗1次,吹干，重悬于500ulTE中。

7、加入1ulRNaseA（10mg/mL），37℃处理1h。

8、用酚（pH80）:氯仿:异戊醇(25:24:1)和氯仿:异戊醇(24:1)各抽提1次。以4℃，10,000rpm，离心5min。

9、取上清，1/10V3MNaAc,25V体积的无水乙醇,-70℃沉淀30min以上。

10、沉淀用75%乙醇漂洗，风干,溶于200ulTE中，-20℃保存备用。

植物基因组提取(CATB法)

作者： 时间：2008-05-13 14:26:27 来源: 生物谷 浏览评论

一、实验目的

掌握植物总DNA的抽提方法和基本原理。学习根据不同的植物和实验要求设计和改良植物总DNA抽提方法。

二、实验原理

通常采用机械研磨的方法破碎植物的组织和细胞，由于植物细胞匀浆含有多种酶类(尤其是氧化酶类)对DNA的抽提产生不利的影响，在抽提缓冲液中需加入抗氧化剂或强还原剂(如巯基乙醇)以降低这些酶类的活性。在液氮中研磨，材料易于破碎，并减少研磨过程中各种酶类的作用。

十二烷基肌酸钠(sarkosyl)、十六烷基三甲基溴化铵(hexadyltrimethyl ammomum bromide，简称为CTAB)、十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate，简称SDS)等离子型表面活性剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使DNA得以游离出来。再加入苯酚和氯仿等有机溶剂，能使蛋白质变性，并使抽提液分相，因核酸(DNA、RNA)水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。上清液中加入无水乙醇使DNA沉淀，沉淀DNA溶于TE溶液中，即得植物总DNA溶液。

三、实验材料

水稻幼叶

四、主要配方

2% CTAB抽提缓冲溶液: CTAB 4g NaCl 16364 g 1M Tris-HCl 20ml( PH80) 05M EDTA 8ml，先用70ml ddH2O溶解, 再定容至200ml灭菌, 冷却后02-1% 2-巯基乙醇 （400ul） 氯仿-异戊醇（24：1）：先加96ml氯仿，再加4ml异戊醇，摇匀即可。

五、实验步骤

1 DNA的提取

（1） 2%CTAB抽提缓冲液在65℃水浴中预热。

（2）取少量叶片（约1g）置于研钵中，用液氮磨至粉状；

（3） 加入700ul的2%CTAB抽提缓冲液，轻轻搅动；

（4） 将磨碎液分倒入15 ml的灭菌中，磨碎液的高度约占管的三分之二；

（5）置于65℃的水浴槽或恒温箱中，每隔10 min轻轻摇动，40 min后取出；

（6）冷却2 min后，加入氯仿-异戊醇（24：1）至满管，剧烈振荡2~3 min，使两者混合均匀；

（7）放入离心机中10 000 rpm离心10 min，与此同时，将600 µl的异丙醇加入另一新的灭菌中；

（8） 10 000 rpm离心1 min后，移液器轻轻地吸取上清夜，转入含有异丙醇的内，将离心管慢慢上下摇动30 sec，使异丙醇与水层充分混合至能见到DNA絮状物；

（9）10000 rpm离心1 min后，立即倒掉液体，注意勿将白色DNA沉淀倒出，将离心管倒立于铺开的纸巾上； （10）60 sec后，直立离心管，加入720 µl的75%乙醇及80 µl 5 M的醋酸钠，轻轻转动，用手指弹管尖，使沉淀与管底的DNA块状物浮游于液体中；

（11）放置30 min，使DNA块状物的不纯物溶解；

（12）10000 rpm离心1 min后，倒掉液体，再加入800 µl 75%的乙醇，将DNA再洗 30 min；

（13）10000 rpm离心30 sec后，立即倒掉液体，将离心管倒立于铺开的纸巾上；数分钟后，直立离心管，干燥DNA（自然风干或用风筒吹干）；

（14）加入50 µl 05 × TE(含RNase)缓冲液，使DNA溶解，置于37℃恒温箱约15 h，使RNA消解；

（15）置于-20℃保存、备用。

2 DNA质量检测

琼脂糖电泳检测，原理和方法见实验二。

六、 注意事项

（1）叶片磨得越细越好。

（2）移液器的使用。

（3）由于植物细胞中含有大量的DNA酶，因此，除在抽提液中加入EDTA抑制酶的活性外，第一步的操作应迅速，以免组织解冻，导致细胞裂解，释放出DNA酶，使DNA降解。

① 护士资格证的考试题型

考题全部是选择题，建议你现在就买套习题做做。

② 护士资格证考试试题完整的卷子

你好，很多学员都想要考试的内容与卷子，这些东西教育局是不允许公开的，而且是统一销毁。

你可以从网上找一些历年真题或者是在群里与一些老考生进行交流，帮助也是很大的。

③ 2013护士资格证总分多少分，多少分过

2013护士资格证总分100分，分数线为：专业实务76分，实践能力78分。

护士执业资格考试包括专业实务和实践能力两个科目。一次考试同时通过两个科目为考试成绩合格。2013年护士执业资格考试成绩合格线为：专业实务76分，实践能力78分。

(3)2013护士资格证考试试题扩展阅读：

专业实务科目考查内容：运用与护理工作相关的知识，有效而安全地完成护理工作的能力。考试内容涉及与健康和疾病相关的医学知识，基础护理和技能，以及与护理相关的社会人文知识的临床运用能力等。

实践能力科目考查内容：运用护理专业知识和技能完成护理任务的能力。考试内容涉及疾病的临床表现、治疗原则、健康评估、护理程序及护理专业技术、健康教育等知识的临床运用等。

④ 2013护士资格证考题是哪出的是军医还是人卫

2013年护士资格考试的考题是全国护士执业资格考试委员会统一组织专家出的题库，然后从题库中抽题出来考。本网提供护士考试的考试大纲下载、相关课程以及其他复习资料，欢迎各位考生关注。

⑤ 护士资格证考试考什么内容

护士执业资格考试包括专业实务和实践能力两个科目，采用纸笔作答方式（自2017年起，已采用人机对话方式）进行。一次考试通过两个科目为考试成绩合格。

答题卡的使用：

1、考试时，应考人员在拿到答题卡后，应首先用黑色、蓝色墨水笔（签字笔）或圆珠笔在答题卡姓名栏填写姓名，在准考证号空白格填写准考证号（ 数字），每格一个数字。

然后用2B铅笔涂黑准考证号数字下面对应的信息点，同时涂黑对应的考试科目的信息框。

2、考试时，要认真阅读试题，找出正确答案，然后在答题卡对应题号下涂黑所选信息点。注意不要错位。

3、填涂技巧：为保证光电阅读器准确无误地识别所涂的信息点，填涂时用铅笔横向涂写数笔，黑度以盖住信息点的[ ]为准。

4、如需要修改，一定要用橡皮擦干净后，再重新填涂。

(5)2013护士资格证考试试题扩展阅读：

考试相关：

从2011年开始，护士资格证书考试只能在一年内将两门通过，否则第二年将全部重考。而且加入了实践能力考试。然后才能通过注册拿到证书。

2014年护士资格考试报名时间：2014年1月30日至2014年2月12日。

2014年护士资格考试准考证打印时间：2014年4月25日至2014年5月17日。

2014年护士资格考试时间：2014年5月17日。

2013年护士资格考试合格标准：专业实务76分，实践能力78分。

2014年护士执业资格考试成绩查询时间为7月10日。

2014年护士资格考试网上报名时间：2013年12月28日至2014年1月16日

2014年护士资格考试现场确认时间：2014年1月3日至2014年1月27日

⑥ 2011护士资格证考试试题，最好是选择题，3Q

护士资格证必考

1 正常人肺部的叩诊音 （清音 ）

2 左心衰竭早期脉搏表现 （ 交替脉 ）

3 呼吸深大、稍快称为 （库斯莫呼吸 ）

4 深昏迷、浅昏迷主要区别 （角膜反射和防御反射是否存在）

5 皮肤异常干燥见于 （脱水）

6 面容枯槁、面色苍白或铅灰、表情淡漠、眼眶凹陷称为 （危重面容）

7 哪种疾病一般无杵状指 （慢性风湿性心脏病 ）

8 库斯莫呼吸特征 （呼吸深大 频率稍快）

9 肠鸣音亢进见于 （急性肠炎 ）

10 腹部出现移动性浊音，提示有（ 恶液质）

11 腹部出现移动性浊音提示有 （腹水）

12 胸骨右缘第二肋间处为哪个瓣膜听诊区 （主动脉瓣第一听诊区 ）

13 最能提示壁层腹膜有炎症的提征是 （腹部反跳痛）

14 为减轻腹膜炎引起的胸痛应采取什么卧位 （患侧卧位）

15 淋巴细胞增多多见于 （ 病毒性感染 ）

16 中性粒细胞增做多见于 （ 急性感染）

17 最能反映贫血的实验室指标为 （血红蛋白定量）

18 心电图连接时，红色导联线应连接 （右上肢）

19 阑尾周围脓肿消退后做阑尾切除术的最佳时间为（ 三个月后手术切除 ）

20 硬膜外麻醉最严重的并发症是 （全脊髓麻醉 ）

21 可作为肿瘤定性的诊断是 （病理检查）

22 关于癌症特征不正确的是 （早期疼痛 ）

23 冬眠疗法护理 （复温时先停冬眠后撤降温）

24 高渗性脱水早期主要表现 （ 口渴 ）

25休克病人的 （平卧位 ）

26 MSOF过程中首先损伤的脏器是（ 肺）

27 溶血性链球菌感染时浓液特点 （脓液稀薄血性）

28 软组织急性化脓性感染时，在出现波动前，应早期切开引流的是 （ 脓性指头炎）

29 抢救伤员应首先处理 （窒息 ）

30 成人基础代谢率为±45，其甲状腺功能为 （ 中度甲亢）

31 急性 炎的主要病因是 （ 乳汁淤积 ）

32 腹外疝的发病基础是 （腹壁有先天性或后天性薄弱破损）

33 持续胃肠减压时间较长时，应加强的护理项目有 （ 口腔护理 ）

34 胃癌最多发生于 （胃窦部 ）

35 门腔静脉吻合术首要目的（ 降低门静脉压力 ）

36 外科急腹症特点 （腹痛在前，发热，呕吐在后）

37 正常骨盆出口平面的横径 （9cm）

38 妊娠合并心脏病的孕妇最易发生心衰的时间（ 32—34周）

39 自我胎动，哪项为异常 （8小时12次）

40 不孕症妇女了解有无排卵的方法 （基础体温测定）

41 急产是指总产程在 （3小时内 ）

42 胎儿娩出多长时间，胎盘尚未娩出者，称胎盘滞留 （30分钟 ）

43 目前诊断子宫内膜异位症的最佳方法（ 腹腔镜检查）

44 妊娠满28周而不满37周终止者称 （早产）

45 与急性肾炎发病有关的细菌 （链球菌）

46 支气管呼吸音常见于 （支气管哮喘）

47 严重呕血病人应暂禁食 （8-24小时）

48 急性胸膜炎病人常取 （患侧卧位 ）

49 通过哪项评估可判断病人需要吸痰 （呼吸困难）

50 口服毒物患者洗胃时,每次洗胃液体量为 （200-300ml）

51 肠鸣音亢进时至少能听到 （10次）

52 发作性呼气性呼吸困难见于 （支气管哮喘 ）

53 胃癌易向何处淋巴结转移 （左锁骨上淋巴结）

54 成人脉压大于5kpa(375mmHG)可见于 （主动脉瓣关闭不全）

55 呼吸中带有 性蒜味的现象见于 （有机磷农药中毒 ）

56 吸气时出现脉搏显著减弱或消失的现象可见于 （心包积液）

⑦ 2013护士资格证考试分数线

真心的觉得题目很偏。希望分数线不要高于80分。要不太不公平了，也考虑下我们的感受，去年简单80分过，今年难不要再提高分数线了

⑧ 2013年护士资格证考试时间

2013年护士考试时间定为5月18日。

2013年护士考试网上报名时间为2013年1月30日至2013年2月25日，现场确认时间2013年1月31日至2013年2月28日。

我网已开通报名入口供考生进行网上报名。

⑨ 2013年护士资格证试题与答案

1。滴虫性 C泡沫状

2。最能反映婴儿营养 C身长

3。肠梗阻 C腹泻

4。骨质疏松 A疼痛

5。卡介苗 A2-3天

7。焦虑性神经症 B惊恐

8。属于青紫型先天（法洛四联症）

9。强迫人格(犹豫不决)

10。胎儿娩出首先（清理呼吸道）

11。风湿性心脏病二尖（B心房颤动）

13使用硫酸镁（E严格控制）

14患者女28（C贫血）

15关于上呼吸道（A保持室内）

168月男婴（D75%）

17肝硬化（A12)

1810岁男孩（D用力）

19关于新生儿（A保管）

20慢性左（C下肢水肿）

23 心肺复舒时-外周静脉

24 患儿男，3岁-青霉素

25 患者女，29岁-硫酸镁

26 患儿女，10个月-加快输液

27 患者女，30岁-母乳喂养

28 患者男，45岁-按压患者

29 患者男，50岁-输液量

30 患者男，80岁-烦躁

3210岁男孩子，+D用力

33健康足月新生儿+E用3%过氧

34患者女，63岁+B手术部位的弹力

35支气管哮喘+B发作性呼吸困难

36患者男，50岁，重症肺炎并发感+C输流量

37患者男48岁 C有利于颅内静脉

38患者男，36岁 C护额里饮食

39患者男，80岁 D烦躁

40新生儿室 C22-24

41患者女，28岁，乏力 c检查是否有贫血41怀疑急性胰腺炎时，首选的检查项目是 C血淀粉酶

42脓性指头炎典型的临床表现是B波动性跳痛

43 患者男19岁车祸致伤 B清除上呼吸道异物，保持呼吸道通畅

44 患者男45岁患有支气管 B需认识到要长期规范治疗哮喘，不得自行停药

45 患者女72岁患帕金森病5年 E将注意力集中于地面

46 新生儿室的室温应保持在 D24摄氏度—26摄氏度

47 患者男32岁，车祸后 A锻炼需贯穿骨折愈合全过程

48 患者男30岁因慢性肾小球 C血压变化

49 患者女66岁高血压病史多年 D知道患者配合进行有效安全防护

50 患者男25岁以胰腺癌收入院 A协助患者抓挠减轻瘙痒

51护士准备按医嘱给患者注射西地兰01mg E05ml

52患者女，63岁，因右下肢静脉曲张行大隐静脉高位结扎术 E包扎后应能及足背动脉搏动

53消化性溃疡患者服用率铝碳酸镁片的正确方法是 D餐前服用

54患者女，60岁，肝硬化10年伴大量腹水 B半卧位，头下加枕

55心包炎患者做出下列哪项表述时 A医院的饭太淡，我自己带了几个咸鸭蛋

56患者男，62岁，支气管肺癌手术后3天 E给予吸痰

57患者女，32岁，因乏力纳差5天 C进行相关检查，若未感染可不做处理

5826岁孕妇，妊娠足月，入院待产 E立即做剖腹产准备

59对尿路感染患者的健康角隅种，错误的是 B长期预防性服用抗生素

60早产儿，生后2天 C胆红素脑病

61患儿男，3个月因多汗，烦燥易惊 D每天要保证1—2小时户外运动

62患者男，58岁，行动不便 D胃镜

63患者女，65岁，患有COPD E快呼吸

64患儿男，5岁，摔倒后左肘关节着地送来急诊 C左上臂畸形

65患者男，62岁，2年前行人工瓣膜置换术 A避免出血

6628岁产妇，2天前经 分娩一女婴 D喂哺后用毛巾和肥皂水清洁 和乳晕

67患者男，62岁，因慢性阻塞性肺疾病合并慢性呼吸衰竭入院治疗 D长期规则服用抗生素

68新生儿女，日龄4天 D无需处理，并告知家长正确认识

69患者女，51岁，主诉月经紊乱半年 B纠正与性激素不足有关的健康问题

70 患者男50岁因前列腺增城症入院 C尽早断粮如跑步等 71 乳腺癌特征性的乳腺 B酒窝征

72 溃疡性结肠炎 A升结肠

73 早期流产最常见的 A胚胎染色体异常

74 患者男68岁被人搀扶步如医院C吸氧测量血压

75 2岁小儿，体验结果示体重10Kg C轻度营养不良

76 护理法洛四联症患儿 A预防形成脑血栓

77 患者女17岁，面部危险三角区D海绵状静脉窦炎

78 支气管哮喘的主要之临床 B发作性呼吸困难伴窒息感

79 阿尔茨海默症五患者的首发 C记忆障碍

80 孕妇，孕30周， A膝胸卧位

81 产妇妊娠39周分娩 D加强宫缩

82 孕妇产前检查时发现胎儿 D孕30周

83风湿性心脏病二尖瓣 B心房颤动

84 患者男68恩岁行胰切除术 C严密观察生命体征报告医生

85 关于肺结核患者 D协助患者健侧卧位，轻拍患者背后 咳嗽

86 胰腺癌的好发 A 胰头

87 流行性腮腺炎 E18天

88 患者男37岁，因 A引流胆汁和减压

89 慢性心功能衰竭患者经保守治疗 E如下我咳嗽发烧，我应当现把剩下的抗生素吃掉然后来复诊

90 我预防风湿性心瓣膜 A长期服用抗风湿药物

91 患者男45岁胸部被撞上 C呼吸

92 患者男40岁因脑外伤住院C降低颅内压

93 患者女68岁有慢性哮喘史 D进行家庭氧疗

94 患者男60岁肝硬化10年 D浅昏迷

95 患者男45岁直肠癌 D常规使用乙醇清洁

96 患者男36岁胃溃疡5年 C胃溃疡的发病机制

97 患者男34岁患支气管扩张症 A在饭后1小时进行

98 可能造成睡眠障碍 E安静环境

99 患者男62岁诊断2型糖尿病 A39mmoi/L

100 健康足月新生儿第2天 E3%过氧化液清洗脐部

101进入第二产程的标志是 A宫口开全

102肺结核的化疗原则不包括 D足量

103患者女，26岁。反复发生皮肤粘膜瘀点 C颅内出血

104自发性气胸的治疗措施中首要的是 E使肺尽早复张

105患者女，42岁，诊断为急性胰腺炎 B低脂低蛋白流质饮食

106慢性胃炎患者腹痛发作时，可以缓解腹痛的护理措施不包括B增加活动量

107护士配合医生进行心包穿刺错作时 B术前准备阿托品

108患者因焦虑入院 A入睡困难

109小儿男，10月龄 常规生长发育检测报告 B12—18个月

110护士查房时观察到某急性胰腺炎患者 A低钙反应

111患者男，20岁，因工程塌方被石板压迫4小时 B挤压伤

112先天性心脏病患儿出院时对家长的健康宣教 B积极参加各种体育活动

113患者男，55岁， 常有搔痒不适 C40摄氏度—45摄氏度

114直肠癌的早期症状是 D排便习惯改变

115患者女，54岁，因近半年来进食吞咽困难就诊 C消瘦

患者男，72岁，1恩个月前因极性脑梗死致左侧肢体偏瘫入院

116社区护士对该患者及家属进行健康教育时 D患肢康训练

117首选的健康教育形式是 D对其进行个别教育

患者男，50岁，因甚至不清、行为异常5天

118患者入院后制定的互利措施不恰当的是 C如有便秘及时用肥皂水

119患者经积极治疗后好转，甚至清醒 C逐步增加蛋白质饮食，以植物蛋白为主

患者女，50岁，一氧化碳中毒2小时入院

120为促进一氧化碳的排出，最佳的措施是 B高压氧舱治疗

121此时护士应将患者安置的 是 E平卧位头偏一侧

患儿男，8岁，双眼浮肿双眼浮肿，尿少3天

122目前患儿最主要的护理问题是 E有皮肤完整性受损的危险

123最常见的并发症是 A感染

124最主要的护理措施是 A绝对卧床休息

患者男，35岁，因失眠，乏力，少语

125评估该患者时首先要注意的问题是 C有无自伤自杀行为

126针对患者首要的心理护理是 E劝阻患者的自杀想法

患者男，70岁，有高血压并史10年

127分诊护士最恰当的处理是 B优先神经外科急诊

128接诊护士在配合医生体检时，不正确的做法是 D头部放置冰袋

题干 新生儿女出生第5天，因全身冰冷

129 最可能的诊断 C新生儿寒冷损伤综合症

130 应首选采取的护理 B复温

题干 患者男41岁体重82Kg，因车祸

131 导致呼吸困难的 C呼吸肌麻痹

132 搬运该患者的方法 E四人搬运，其中三人将患者平脱到木板上，一周固定头颈部

133 在与患者的沟通中，会对患者 A向患者介绍脊髓损伤的手术并发症

题干 患者女25岁，患风湿性心脏

134 现遵医嘱行血培养检查 A第1恩日间隔1h采血，共3次，体温升高时采血

135 入院后心脏彩超检查 C动脉栓塞

2013年5月18号上午第一门护士资格考试答案2013年5月18号上午第一门护士资格考试答案：1——5EBABD6——10DBCCC 11---15CACBA 16---20CABAB 21—25CCDBE26—30CCCBE 31---35DBCBC 36—40BBABC 41—45CDAEC 46—50AACDE51—55ECEED 56---60BBBBE 61---65CDCBC 66—70DEDEA 71—75ADDCB76—80CEADC 81—85EAECC 86—90 ECBBA 91—95DEEEE 96—100EAEAB101—105CBDBA 106—110EACAD 111—115EBEBA 116—120EABBC 121—125ACDCD 126—130EDBBC 131-135DBBAB

1、体温单底栏 选 e胃液引流量

2、在传染区 选 病室

3护理质量标准合格率 选 100%

4新生儿不包括 选 角膜反射

5、对青春期孩子选d 性心理教育

6、不属于中医急d痿症

7、食管癌转移 b淋巴转移

8、急性白血病出血c血小板和量异常

9、破伤风抗毒素c15iu

10、幼儿期指c1岁—3岁

11患男28岁因车祸c家属结果无法接受

12患者女37岁出租车司机a上行感染

13、手术室的室温c22—24度

14患者男29岁外伤昏迷b清除空腔一切细菌

15、结肠的主要功能a吸收水分何盐类

16、甲状腺亢进常见于c激动易怒

17、泌尿系肿瘤a无痛性全程内验血尿

18为婴儿注射b颞浅静脉

19、患者男58岁肥厚性心肌病a角色行为强化

20、患者男39岁近日咳嗽b慢性病容

21下列信息属于客观材料c体温391度

22、某新生儿确诊低钙血症c防止心动过缓保持心率100次

23患者男50岁外伤入院d氧中毒

24关于护士坐姿b上身挺直抬头

25护士为一级护理e诊疗间歇中进行临睡前

26在乡卫生院c72ml

27糖皮质激素治疗c控制炎症抑制免疫反应

28小儿男现体重9kgc12个月

29最容易导致癔症b敏感

30患者男38岁因肺部感染e皮下注射盐酸肾上腺素

31患者男，50岁平常嗜酒最可能的疾病是D急性

32患者男65岁脑梗赛入院正确的方法是B热水外裹毛巾

33支气管肺炎患儿体用体温正常是C5-7天

34拔火罐的适应症是B外感风寒，风寒湿pi

35患者女，34岁。昨晚夜间多梦该项医嘱栏内C用红笔写上未用

36护士遵医嘱抽无回血可能原因是B针刺入过度，穿破对血管壁

37右心功能不全生理基础是B体循环淤血

38患者女，3岁首选的处理方法是A地塞米松雾化吸入

39法洛四联症目的是B减慢心率

40患者男55岁立即采取的措施是C心肺复苏

41患者男79患者存在C爱与归属的需要

61护士为破伤风患者处理C集中焚烧

62引起肛瘘最常见的 D 直肠钢管周围浓重

63护士了解到病房内的一位患者有吸毒史C患者的主治医师

64关于婴儿呼吸系统B婴儿呼吸节律很规整

65患者男,33岁,干咳、胸闷C避免闭气用力

66患者女，28岁，双侧D指导患者多做运动

67慢性肺袁性心脏病的 A左心室肥厚

68门静脉系与腔静脉之间D胃底、食管

69精神分裂证的遗传方式最可能的是E常染色体隐性遗传

70在使用胰岛素过程中A对胰岛素敏感导致血糖降低

71治疗外阴A杀菌

72患者女40岁上午D屈膝

73患者女38岁大面积烧伤D大量体

74一位患者因胆绞痛C校医嘱执行

75患者男50岁。因高热B前额，头顶

76支气管扩张患者C恐惧

77艾滋病防治条例E与其有性关系者

78患者女60岁因A淤血红润期

79患者女36岁长期吸烟D阴经套

81某使用静脉留置针的患者不是导致的原因是E封官的肝，，浓度过大

82患者男，68岁脑出血入院最可能的原因是A正在对患者抢救

83年轻男性患者因车祸不妥的是E运送期间暂时停止输液

84哈U那种女，28岁习惯性流产正确的操作是C选择粗长针头注射

85需避光使用的药物是C硝普钠

8630岁初产妇40周男婴不良后果是E胎盘剥落不全

87患者男67岁，饮食为C高热量、高蛋白、高维生素半流食

88患者女，70岁处理措施是B冷敷

89、地高辛用于作用是B增强心肌收缩力

90某护士在一所二级甲等医院A护士条例

91患者在诊疗活动中D医务人员和医疗机构

92正常情况下，胰夜进如十二指肠E胰蛋白酶元

93患者女，78岁，在全麻下进行C用75%酒精擦洗局部皮肤

94为敌百虫中毒患者进行洗胃时E碳酸氢钠溶液

95患者男，89岁，因腹部隐痛E提供3%碳酸氢钠溶液漱口

96护士甲与护士乙E心理因素

97胃溃疡的好发部位A胃小弯

98高血压病的治疗E 性干咳

99患者男，58岁，冠心病史6年A焦虑

100通过解除紧张情绪缓解的B房型提前收缩

101关于人体器官叙述正确C活体器官的捐献与接收

102最容易发生骨肉瘤转移的 B肺

103献血法规定D地方各级采供血机构

105患者女。50岁初诊为高血压A猪肝

106患儿 4岁，因肺炎入院E对患儿拒绝治疗的行为进行批评

107患者男，65岁，因尿血来诊A愤怒期

108最容易引起听神经损害链霉菌

109患者男，29岁，以脑膜炎入院A潮式呼吸

110肝胆外科病区护士夜班D肝胆外科病区护士

111对血糖在正常范围E二甲双挂

112患者女，34岁，因呕吐腹泻B 您快点去卫生间回来就要输液

113关于输血的叙述错误的是 E输血完毕后及时将输血器、血袋物品进行消毒

114便秘患者应用液体石蜡导致 B润滑臂肠，软化粪便

115青春期女孩第二性征表现不包括 A智齿萌出

116在间隔病区工作护士的下列 E护理结核患者后立即更换口罩

117有机农药中毒患者的尿液气味 A蒜臭味

118治疗厌氧菌感染的急性盆腔B 甲硝挫

119H译成中文的正确 B皮下注射

120每日给药次数 C每日三次

121合适的注射 A胸部

122护士在抢救结束 C6小时内

123患者需要复印 D医学影像

124该患者发热的C稽留热

125为明确诊断D石蜡浊试管

126采集上述 E血培养瓶抗凝试管

127患者男，56岁 D左侧

128 结束后，护士应嘱患者D5~10分钟

129改患者发生了B急性废水肿

130此时，护士应为患者C端坐位

131给氧时，护士 D6~8L

132造成该事件B护士没有升起

133根据对患者照成B一级医疗

134改护士A自主

135该家属的行为B自觉遵守医院

⑩ 护士资格证考题类型和分值类型是什么

护士执业资格考试包括专业实务和实践能力两个科目，采用纸笔作答方式（自2017年起，已采用人机对话方式）进行。一次考试通过两个科目为考试成绩合格。分四个半天进行。试卷题量为100题/科，满分为100分/科，考试时间为120分钟/科。

考题全部为选择题，题型有A1、A2、B1、A3、A4和X型题。

从2011年开始，护士资格证书考试只能在一年内将两门通过，否则第二年将全部重考。而且加入了实践能力考试。然后才能通过注册拿到证书。

(10)2013护士资格证考试试题扩展阅读：

申请护士执业注册，应当具备下列条件：

（一）具有完全民事行为能力；

（二）在中等职业学校、高等学校完成教育部和卫生部规定的普通全日制3年以上的护理、助产专业课程学习，包括在教学、综合医院完成8个月以上护理临床实习，并取得相应学历证书；

（三）通过卫生部组织的护士执业资格考试；

（四）符合本办法第六条规定的健康标准。

护士执业资格考试实行国家统一考试制度。统一考试大纲，统一命题，统一合格标准。护士执业资格考试是作为单位聘任相应技术职务的必要依据。考试通过后相关部门会下发护士资格证书。