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同人：https://gss0baiducom/7LsWdDW5_xN3otqbppnN2DJv/%C3%C0%C9%D9%C5%AE%D0%A1y/pic/item/b0544bffcbe4b5155d6008ecjpeg

漫画版：https://gss0baiducom/7LsWdDW5_xN3otqbppnN2DJv/501648064/pic/item/51bae46593350eeff7365496jpeg

Q版：https://gss0baiducom/7LsWdDW5_xN3otqbppnN2DJv/%D1%A9%B7%C9%C2%FB%CE%E8/pic/item/15f1d8fc97ba570908244d43jpeg

断层线—岩石破碎易被风化侵蚀成沟谷,泉,或湖泊 上升的岩块形成块状山或高地 下沉的岩块常形成谷地 ---- http://cachebaiducom/cm=9d78d513d9d431ab4f9ce0697d16c011184381132ba6a40209a08448e2732a445010e7ac56510774d5d27c1616d94b4b9b872102361451bc8cc8f95dadbc855e259f5136676df155559347a091006383379129f4b248bbebe732e4e583988e03058d44050dd1add44747569432a34265b8f8ce55155d12bde63365fc5e712a992246b04ceee045385ad0&p=8c6ac64ad79e07f00ebd9b7e5c&user=baidu

团体标准T/CVMA 5—2018

非洲猪瘟病毒实时荧光PCR检测方法

Real-time PCR assay for detection ofAfrican swine fever virus

中国兽医协会发布

前言

本标准按 GB/T 11-2009给出的规则起草。

本标准由中国兽医协会提出并归口。

本标准起草单位： 中国动物疫病预防控制中心、中国兽医药品监察所、中国农业科学院哈尔滨兽医研究所、中国农业科学院兰州兽医研究所、北京海关。

本标准主要起草人： 倪建强、王传彬、王琴、仇华吉、殷宏、杨林、辛盛鹏、刘艳华、刘洋、宋晓晖、赵启祖、罗玉子、刘志杰、张乾义、乔彩霞、夏应菊、杨吉飞、徐璐、顾小雪、亢文华、李硕、毕一鸣。

1、范围

本标准规定了非洲猪瘟病毒实时荧光PCR检测方法的试剂、仪器和耗材、操作步骤、结果判定、实验室生物安全等技术要求。

本标准适用于猪脾脏、淋巴结、血液等组织和血粉中非洲猪瘟病毒核酸的检测。

2、规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB 19489 实验室 生物安全通用要求

NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范

3、试剂

31 DNA提取试剂

DNA提取试剂的配制见附录A，或选取商品化的病毒DNA提取试剂盒并参照说明书进行DNA提取。

32 2 × PCR缓冲液

2 × PCR缓冲液的配制见附录A。

33 引物探针

331 采用针对非洲猪瘟病毒VP72基因（核苷酸序列见附录B）的引物及探针：

上游引物ASF-CADC-rPCRF：5'-1528-ATAGAGATACAGCTCTTCCAG-1548-3'

下游引物ASF-CADC-rPCRR：5'-1660-GTATGTAAGAGCTGCAGAAC-1679-3'

荧光探针ASF-CADC-Probe：5'-1638-FAM-TATCGATAAGATTGAT-MGB-1653-3'

332 可以使用世界动物卫生组织（OIE）在陆生动物诊断技术和疫苗手册（Manual of Diagnostic Tests andVaccines for Terrestrial Animals）第281章African Swine Fever中提供的引物和探针，并按照手册中规定的检测程序和判定标准操作：

上游引物ASF-OIE-rPCRF：5'-1627-CTGCTCATGGTATCAATCTTATCGA-1651-3'

下游引物ASF-OIE-rPCRR：

5'-1857-GATACCACAAGATCRGCCGT-1876-3'

荧光探针ASF-OIE-Probe：

5'-1761-FAM-CCACGGGAGGAATACCAACCCAGTG-TAMRA-1785-3'

333 使用国家农业行政主管部门批准的其他引物、探针，应对检测程序和判定标准作相应调整。

34 阴性及阳性对照

阴性及阳性对照的制备方法见附录C。

35 其他试剂

消毒液、5U/μLTaq DNA聚合酶、无菌无核酸酶水、001mol/L PBS（pH72）。

消毒液配制见附录A， 001mol/L PBS配制见附录A。

4、仪器和耗材

分析天平（感量01mg）、高速台式冷冻离心机（最高离心速度不低于12 000r/min）、冰盒、实时荧光PCR仪及配套反应管（板）、组织研磨器、-20℃冰箱、可调移液器（2 μL，20 μL，200μL，1 000 μL）、15mL离心管（无核酸酶）。

5、操作步骤

51 样品采集及运输

样品采集及运输按照NY/T541的规定执行，采集猪的脾脏、淋巴结、血液等组织材料或血粉用于检测，样品应在冷藏条件下尽快运输至实验室，避免反复冻融。采样时应穿戴个人生物安全防护装备，实施现场消毒和废弃物处理。

52 样品处理

检测前样品应在二级生物安全柜中处理。取01g～02g组织或血粉，经研磨破碎后加1mL的001mol/L PBS（pH72）制成匀浆，经12 000 r/min离心2Min取上清；全血、血清样品直接取1mL，置于15 mL离心管内盖紧管帽。将上述处理的样品置于60℃条件下灭活30min。

53 样品保存

采集或处理好的样品在2℃～8℃条件下保存应不超过24 h；如需长期保存，应放置-70℃冰箱，但应避免反复冻融（冻融不超过3次）。

54 病毒DNA提取

541 DNA提取应在样本制备区内采用以下方法进行，若使用其他等效的病毒DNA提取试剂，则按照试剂说明书操作。

542 待检样品、阳性对照和阴性对照的份数总和用n表示，取n个灭菌15 mL离心管，逐管编号。

543 每管加入200μL DNA提取液1，然后分别加入待测样品、阴性对照和阳性对照各200μL，1份样品换用1个吸头，混匀器上震荡混匀5s。于4℃～25℃条件下，13 000 r/min离心10 min。DNA提取液1见附录A。

544 尽可能吸取上清、弃去，吸头不要碰到沉淀，再加入10 μL DNA提取液2，混匀器上震荡混匀5 s。于4℃～25℃条件下，2 000 r/min离心10s。DNA提取液2见附录A。

545 100℃干浴或沸水浴10 min。

546 加入90μL无DNA酶的灭菌去离子水，13 000 r/min离心10 min，上清即为提取的DNA，-20℃保存备用。无DNA酶的灭菌去离子水见附录A。

55 实时荧光PCR操作

551 在反应混合物配制区、样品制备区和检测区分别进行552～554。

552 每个检测反应体系需使用20μL实时荧光PCR反应液。根据542中设定的n值，按附录D配制反应液，充分混匀后分装，每个PCR反应管20μL。转移PCR反应管至 样品制备区 。

553 在上述552的反应管中分别加入54中提取的DNA溶液5μL，使每管总体积达到25 μL，记录反应管对应的样品编号。盖紧管盖后，瞬时离心。

554 将553加样后的反应管放入实时荧光PCR检测仪内，记录反应管摆放顺序。选定5-羧基荧光素（FAM）作为报告基团，小沟结合物（MGB）为淬灭基团，反应参数设置如下： 预变性95℃/3 min；95℃/15 s，52℃/10 s，60℃/35 s，45个循环； 在每次循环的60℃退火延伸时收集荧光。试验结束后，根据收集的Ct值和荧光曲线判定结果。

6、结果判定

61 结果分析条件设定

实时荧光PCR检测阈值设定原则：阈值线超过阴性对照扩增曲线的最高点，且相交于阳性对照扩增曲线进入指数增长期的拐点，或根据仪器噪声情况进行调整。每个样品反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数即为Ct值。

62 结果描述及判定

当阳性对照Ct值≤280且出现典型扩增曲线，阴性对照无Ct值无扩增曲线时，实验成立，实例参考附录E。 当被检样品出现典型的扩增曲线且Ct值≤380时，判为非洲猪瘟病毒核酸阳性 ； 被检样品无Ct值，判为非洲猪瘟病毒核酸阴性；对于Ct值＞380的样品且出现典型的扩增曲线，应重检，重检仍出现上述结果的判为阳性，否则判为阴性。

7、实验室生物安全要求

71 本方法涉及非洲猪瘟感染性样品的实验操作应在（动物）生物安全三级试验室中进行，实验室生物安全管理要求见GB 19489。国家农业行政主管部门另有规定的，按其规定执行。

72 使用过的实验器材和液体废弃物应先经过消毒液浸泡处理，再经高温高压处理后废弃。剩余样品等固体废弃物应在生物安全柜中密封包装，经表面消毒后移出，再经高温高压处理后废弃。

一

附录 A (规范性附录) 试剂的配制

A1 DNA提取液1

PEG8000晶体2074g，NaCL1753g，加去离子水定容到100 mL。

A2 DNA提取液2

1mol/LTrisHcl 2 mL，2 mol/L KCL5 mL，05 mol/L EDTA 05 mL，NP-40 1 mL，加去离子水定容到100 mL。

即KCL14912g，Tris碱12114g，12068 mL浓HCl，EDTA14612g，NaOH 6g, 加去离子水定容到100 mL。

A3 2×PCR缓冲液

灭菌去离子水 70 mL

三羟甲基氨基甲烷（Tri s） 079 g

氯化钾 1865 g

曲拉通X-100 05 mL

dATP (100mmol/L) 25 mL

dTTP (100mmol/L) 25 mL

dGTP (100mmol/L) 25 mL

dCTP (100mmol/L) 25 mL

六水氯化镁 061 g

盐酸 调pH至90

灭菌去离子水 加至100 mL

A4 消毒液

8‰氢氧化钠或3‰福尔马林或3%邻苯基苯酚或碘化合物等其他消毒试剂均可。

A5 磷酸盐缓冲液（PBS）的配方

A51 A液

02mol/L磷酸二氢钠水溶液：NaH2PO4·H2O 276 g，溶于蒸馏水中，最后定容至1 000 mL。

A52 B液

02mol/L磷酸氢二钠水溶液：Na2HPO4·7H2O 536 g（或Na2HPO4·12H2O 716 g或Na2HPO4·2H2O 356 g），加蒸馏水溶解，最后定容至1 000 mL。

A53 001 mol/L、pH 72 磷酸盐缓冲液（PBS）的配制

取A液14 mL、B液36 mL，加NaCl 85 g，用蒸馏水定容至1 000 mL。经过滤除菌后，无菌条件下分装。

A6 无DNA酶的灭菌去离子水

无DNA酶的灭菌去离子水是用1 %DEPC处理后的去离子水，电阻应该大于182mΩ。

二

附录B （资料性附录）非洲猪瘟病毒VP72基因参考序列

1ATGGCATCAG GAGGAGCTTT TTGTCTTATT GCTAACGATG GGAAGGCCGA CAAGATTATA

61TTGGCCCAAG ACTTGCTGAA TAGCAGGATC TCTAACATTA AAAATGTGAA CAAAAGTTAT

121GGGAAACCCG ATCCCGAACC CACTTTGAGT CAAATCGAAG AAACACATTT GGTGCATTTT

181AATGCGCATT TTAAGCCTTA TGTTCCAGTA GGGTTTGAAT ACAATAAAGT ACGCCCGCAT

241ACGGGTACCC CCACCTTGGG AAACAAGCTT ACCTTTGGTA TTCCCCAGTA CGGAGACTTT

301TTCCATGATA TGGTGGGCCA TCATATATTG GGTGCATGTC ATTCATCCTG GCAGGATGCT

361CCGATTCAGG GCACGTCCCA GATGGGGGCC CATGGGCAGC TTCAAACGTT TCCTCGCAAC

421GGATATGACT GGGACAACCA AACACCCTTA GAGGGCGCCG TTTACACGCT TGTAGATCCT

481TTTGGAAGAC CCATTGTACC CGGCACAAAG AATGCGTACC GAAACTTGGT TTACTACTGC

541GAATACCCCG GAGAACGACT TTATGAAAAC GTAAGATTCG ATGTAAATGG AAATTCCCTA

601GACGAATATA GTTCGGATGT CACAACGCTT GTGCGCAAAT TTTGCATCCC AGGGGATAAA

661ATGACTGGAT ATAAGCACTT GGTTGGCCAG GAGGTATCGG TGGAGGGAAC CAGTGGCCCT

721CTCCTATGCA ACATTCATGA TTTGCACAAG CCGCACCAAA GCAAACCTAT TCTTACCGAT

781GAAAATGATA CGCAGCGAAC GTGTAGCCAT ACCAACCCGA AATTTCTTTC ACAGCATTTT

841CCCGAGAACT CTCACAATAT CCAAACAGCA GGTAAACAAG ATATTACTCC TATCACGGAC

901GCAACGTATC TGGACATAAG ACGTAATGTT CATTACAGCT GTAATGGACC TCAAACCCCT

961AAATACTATC AGCCCCCTCT TGCGCTCTGG ATTAAGTTGC GCTTTTGGTT TAATGAGAAC

1021GTGAACCTTG CTATTCCCTC AGTATCCATT CCCTTCGGCG AGCGCTTTAT CACCATAAAG

1081CTTGCATCGC AAAAGGATTT GGTGAATGAA TTTCCTGGAC TTTTTGTACG CCAGTCACGT

1141TTTATAGCTG GACGCCCCAG TAGACGCAAT ATACGCTTTA AACCATGGTT TATCCCAGGA

1201GTCATTAATG AAATCTCGCT CACGAATAAT GAACTTTACA TCAATAACCT GTTTGTAACC

1261CCTGAAATAC ACAACCTTTT TGTAAAACGC GTTCGCTTTT CGCTGATACG TGTCCATAAA

1321ACGCAGGTGA CCCACACCAA CAATAACCAC CACGATGAAA AACTAATGTC TGCTCTTAAA

1381TGGCCCATTG AATATATGTT TATAGGATTA AAACCTACCT GGAACATCTC CGATCAAAAT

1441CCTCATCAAC ACCGAGATTG GCACAAGTTC GGACATGTTG TTAACGCCAT TATGCAGCCC

1501ACTCACCACG CAGAGATAAG CTTTCAGGAT AGAGATACAG CTCTTCCAGA CGCATGTTCA

1561TCTATATCTG ATATTAGCCC CGTTACGTAT CCGATCACAT TACCTATTAT TAAAAACATT

1621TCCGTAACTG CTCATGGTAT CAATCTTATC GATAAATTTC CATCAAAGTT CTGCAGCTCT

1681TACATACCCT TCCACTACGG AGGCAATGCG ATTAAAACCC CCGATGATCC GGGTGCGATG

1741ATGATTACCT TTGCTTTGAA GCCACGGGAG GAATACCAAC CCAGTGGTCA TATTAACGTA

1801TCCAGAGCAA GAGAATTTTA TATTAGTTGG GACACGGATT ACGTGGGGTC TATCACTACG

1861GCTGATCTTG TGGTATCGGC ATCTGCT

三

附录C （规范性附录）非洲猪瘟病毒核酸阳性及阴性对照

C1阳性对照

阳性对照制备方法：人工合成非洲猪瘟病毒VP72基因片段，序列参见附录B，将VP72基因连接于pMD20-T载体制成阳性质粒pMD20-T-VP72，使用非洲猪瘟病毒阴性猪的组织研磨液将质粒稀释至浓度为10 000copies/L，保存于-20℃备用。

C2 阴性对照

阴性对照为非洲猪瘟病毒阴性猪的组织研磨液。

四

附录D （规范性附录）实时荧光PCR反应液配方

实时荧光PCR反应液配方见表D1。

表D1 实时荧光PCR反应液配方

组 分

1个检测体系的加入量

2×PCR 缓冲液a

125μL

dNTP（25 mmol/L）

10 μL

上游引物（10 μmol/L）

10 μL

下游引物（10 μmol/L）

10μL

探针（10 μmol/L）

10 μL

Taq 酶b（5U/μL）

05μL

去离子水

3μL

总体积

20μL

2×PCR 缓冲液a: 参见附录A1配方。

Taq 酶b：具有5’→3’外切活性。

五

附录 E （资料性附录）非洲猪瘟病毒实时荧光PCR扩增实例参考

图D1给出了非洲猪瘟病毒实时荧光PCR扩增实例。

图E1 非洲猪瘟病毒核酸实时荧光PCR典型扩增曲线示意图

(资料来源：中国兽医协会）

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2022-11-30

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亿健跑步机显示e11怎么回事

心语者小何

活跃之星

您好，亿健跑步机显示E11是下控主板坏了哦，跑步机维修，跑步机通电后按启动键时间倒计完成，如果不转动，看下显示屏上有没有以E开头闪烁的故障代码和滴滴滴的故障警告声，像这样的情况出现都是下控主板烧坏了造成的，其它部题就是跑步机的上表问题

2022-11-30

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2022-11-25

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亿健跑步机e10故障怎么解决

果果数码老师

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亿健跑步机e10故障怎么解决您好亲，这个应该是跑步机老化 然后造成负载过大； 现在有两种解决方案，一种是你自己去换条新跑带 这样负载就会正常；第二种是 你可以把主板寄回给我们，给把过载保护的电流调大，这样的话，你到时使用过程中 如果有闻到异味 就要停止使用 让跑步机休息一下，再继续使用。希望可以帮到您哦。

2022-10-19

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亿健跑步机e01是什么故障

数码达人可颂

数码发烧友

亲，您好！E01：信号未正常连接到表盘上。检查信号线，信号线上有三个接口，每个接口处有四个顶针，有没有弯曲和不平。信号线部位检查，底座与立管连接部位、立管中间上横杆部位、立管与扶手连接部位、表盘背部与扶手固定部位（4处）。主要问题：连接是否正常，变压器电压是否少一组电压，控板和表盘线路板虚焊、假焊没有异常，则需更换控板和变压器。希望能帮助到您希望能帮助到您！

2022-11-30

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第一轴和中间轴: d/L=016 ~ 018;

第二轴: d/L=018 ~ 021。 前面算过,5 挡变速器壳体的轴向尺寸取 3A,则 L=363mm,中间轴两支撑 间距离略