关于ELISA，正确的是

答案：D

1971年Engvall和Perlmann发表了酶联免疫吸附剂测定(ELISA)用于IgG定量测定的文章。这一方法的基本原理是：①使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。②使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在测定时，把受检标本(测定其中的抗体或抗原)和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入底物后，底物被酶催化变为有色产物，通过定性或定量检测有色产物的量即可确定样本中待测物质含量。由于酶的催化频率很高，故可极大地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。本题正确答案是D。

目录 1 拼音 2 英文参考 3 概念 4 抗血清的种类 5 抗血清的制备 51 动物的选择 52 免疫剂量、时间和途径 53 动物采血法 6 抗血清的鉴定 61 双向免疫扩散法鉴定抗体的特异性 62 双向免疫扩散法则定抗血清效价 63 其他鉴定方法 7 抗血清的保存 8 抗血清中抗体的纯化 81 除去杂抗体有两种方法： 82 特异性IgG抗体的制备 这是一个重定向条目，共享了抗血清的内容。为方便阅读，下文中的 抗血清 已经自动替换为 免疫血清 ，可 点此恢复原貌 ，或 使用备注方式展现 1 拼音

miǎn yì xuè qīng

2 英文参考

immune serum

3 概念

抗血清亦称免疫血清。含有抗体的血清制剂。

4 免疫血清的种类

抗血清种类很多，包括抗毒素、抗菌血清、抗病毒血清、抗Rh血清等。

（1）抗毒素，将类毒素多次免疫动物（常用马）后，采取动物的抗血清，经浓缩纯化后制得。主要用于治疗细菌外毒素所致疾病。常用的有白喉抗毒素、破伤风抗毒素。

（2）抗菌血清，在本世纪40年代以前曾用抗肺炎、抗百日咳、抗炭疽等抗菌血清治疗有关疾病。自从磺胺类药物和抗生素大量应用后，已极少应用于临床治疗。但对一些耐药菌株引起的感染，可用抗菌血清治疗。如对绿脓杆菌引起的感染的治疗。

（3）抗病毒血清，用病毒免疫动物，取其血清精制而成。目前对病毒病的治疗尚缺乏特效药物。故在某些病毒病的早期或潜伏期，可考虑用抗病毒血清治疗。如用抗狂犬病毒血清与抗狂犬疫苗同时对被狂犬严重咬伤者进行注射，可防止狂犬病的发生。生。

（4）抗Rh血清，能作用于Rh阳性（Rh ）红细胞，临床上常用提纯的抗Rh球蛋白预防Rh新生儿溶血症（见Rh免疫球蛋白）。

5 免疫血清的制备 51 动物的选择

选择合适的动物进行免疫极为重要。选择时应考虑以直几个因素：①抗原与免疫动物的种属差异越远越好；亲缘关系太近不易产生抗体应答（如兔－大鼠之间，鸡－鸭之间）。②免疫血清量的需要：大动物如马、骡等可获得大量血清（一头成年马反复采血可获得10000ml以上的免疫血清）；但有时抗体需要是不多，选用家兔或豚鼠即可。③免疫血清的要求：免疫血清可分为R型和H型。H型免疫血清用于沉淀反应较难掌握，因而极少应用。④抗原的选择：对蛋白质抗原，大部分动物皆适合常用的是山羊和家兔。但是，在某些动物体内有类似的物质或其它原因，对这些动物免疫原性极差，如IgE对绵羊、胰岛素对家兔、多种酶类（如胃蛋白酶原等）对山羊等，免疫时皆不易出现抗体。这些物质有时可以用豚鼠（如胰岛素等）、火鸡、甚至猪、狗、猫等作试验免疫。⑤甾体激素免疫多用家兔；酶类免疫多用豚鼠。

52 免疫剂量、时间和途径

免疫原合适剂量的选定应考虑抗原性强弱、分子量大小和免疫时间。抗原需可量多，时间间隔长，剂量可适当加大。大动物抗原剂量（以蛋白抗原为准）约05～1mg/只，小动物约01～06mg/只。有时主观希望加强免疫效果而不适当地加大剂量，往往会弄巧成拙。因为剂量加大极易造成免疫耐受（免疫抑制）而遭失败。已有证明，几微克的蛋白质也能很好地免疫出免疫血清。

免疫注射的途径也很重要。一般采用多点注射，一只动物注射总数约为8～10点，包括足掌及肘窝淋巴结周围，背部两侧、颌下、耳后等处皮内或皮下，皮内易引起细胞免疫反应，对提高抗体效价有利。但皮内注射较困难，特别是天冷时更难注入（因佐剂加入后粘度较大）。其他途径还有肌内、腹腔、静脉、脑内等，但较少应用。如抗原极为宝贵可采用淋巴结内微量注射法，抗原只需10～100μg；方法是先用不完全佐剂在足作基础免疫（预免疫），10～15天后可见肘窝处有肿大的淋巴结（有时在腹股沟处触及），用两手指固定好淋巴结，消毒后用微量注射器直接注射入抗原（一般不需要佐剂）。

免疫间隔时间也是重要因素，特别是首次与第二次之间更应注意。第一次免疫后，因动物机体正处于识别抗原和B细胞增殖阶段，如很快接着第二次注入抗原，极易造成免疫抑制。一般以间隔10～20天为好。二次以后每次的间隔一般为7～10天，不能太长，以防 变弱，抗体效价不高。对于半抗原的免疫间隔则要求较长，有的报告1个月，有的长达40～50天，这是因为半抗原是小分子，难以 机体发生免疫反应之故。免疫的总次数多，多为5～8次。如为蛋白质抗原，第八次免疫未获得抗体，可在30～50天后再追加免疫一次；如仍不产生抗体，则应更换动物。半抗原需经长时间的免疫才能产生高效价抗体，有时总时间为一年以上。

53 动物采血法

动物免疫3～5天后，如免疫血清鉴定合格（见下节），应在末次免疫后5～7天及时采血，否则抗体将会下降。因故未及时取血，则应补充免疫一次（肌肉、腹腔或静脉内注射，不加佐剂），过5～7天取血。

1．颈动脉放血法这是最常用的方法，对家兔、山羊等动物皆可采用。在动物颈外侧做皮肤切口，拉开皮肤后可见斜行的胸锁乳突肌，将此肌钝性分离并推向后方，即可见到淡红色有弹性的总动脉。将此动脉轻轻游离（连同与之同行的迷走神经），用丝线将远心端结扎，近心端用止血钳夹住，另一止血钳夹住动脉迷走神经，用以固定。沿结扎处剪断血管，用固定止血钳将断端放入瓶口，慢慢打开夹持的止血钳，动脉血立即喷射入瓶。如此放血的速度快，动物死亡也快，取血量略少于其他放血法。如在放血大约总量的一半时，暂时将动脉夹住片刻，再继续放血，得血量可以多些。

另外一种慢放血法是在动脉内插入一采血器，用闭式放血。在颈动脉内插入一较粗的玻璃管，将血管与玻璃管用线扎牢，玻璃管接一橡皮管引血入瓶，也极为方便。

2．心脏采血法此法多用于豚鼠、大鼠、鸡等小动物。采血技术应熟练，穿刺不准容易导致动物急性死亡。

3．静脉多次采血法家兔可用耳中央静脉，山羊可用颈静脉。这种放血法可隔日一次，有时可采集多量血液。如用耳静脉切开法，一只家兔可采百余毫升血液（用颈动脉放血最多可获70～80ml，一般只有50ml左右）。用颈静脉采集绵羊血，一次可放300ml，放血后立即回输10％葡萄糖盐水，三天后仍可采血200～300ml。动物休息一周，再加强免疫一次，又可采血二次。如此，一只羊可获1500～2000ml血液。小鼠取血往往采取断尾或摘除眼球法，每鼠得血一般不超过2ml。

免疫血清的分离多采用室温自然凝固，然后放置37℃或4℃待凝块收缩。前者迅速，但得血清较少；后者时间长，有时还会出现溶血，但获得血清多，而且效价不会下跌。

免疫血清分出后是否要经56℃30min灭活有两种不同意见。一种认为血清中有许多活性酶，特别是球蛋白的降解酶，如不清除，血清存放过程中将导致抗体效价下降。另外的意见认为，这种自然降解是微不足道的，56加温后，有些球蛋白会发生热变性或者热聚合。含这种聚合大分子蛋白的免疫血清用于免疫浊度试验时，可因沉淀剂（如PEG）的加入而发生假性混浊。

6 免疫血清的鉴定

动物血采集后，立即分离出血清，此免疫血清在保存或应用前，必须作效价和特异性鉴定。

61 双向免疫扩散法鉴定抗体的特异性

按双向免疫扩散技术打两排孔，上排放抗原粗提物（如抗原来自动物血清则放相应的混合血清）和纯化抗原，下排加免疫血清，进行双扩散18～24h后，仔细观察上下两排孔之间出现的沉淀线。若与粗抗原及纯抗原之间皆出现一条沉淀线，且两者互相融合，则证明该动物已产生单价特异性抗体；不出现沉淀线，表明示免疫成功。若与纯化抗原出现一条，而与粗抗原出现多条线，且其中一条沉淀线与纯抗原沉淀线相连接，也是成功的免疫，待取血后将杂抗体吸收去除，可以成为单价特异性抗体。

62 双向免疫扩散法则定免疫血清效价

测定免疫血清效价有两种稀释方法：一是稀释免疫血清，如1/2、1/4、1/8、1/16对倍稀释，分别与一个浓度的纯抗原反应；另一是稀释抗原，即把抗原作对倍稀释或按浓度（如mg/ml）进行稀释，分别与不同浓度的免疫血清进行双扩散试验（称为棋盘滴定），见表101。

表101免疫血清效价测定

抗原 免疫血清 不稀释 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 不稀释 ＋＋＋ ＋＋＋ ＋＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋ － － 1/2 ＋＋＋ ＋＋＋ ＋＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋ － － 1/4 ＋＋＋ ＋＋＋ ＋＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋ － － 1/8 ＋＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋ ＋ － － 1/16 ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋ ＋ ＋ － － 1/32 ＋ ＋ ＋ ＋ － － － － 1/64 ＋ ＋ ＋ ＋ － － － －

表中＋～＋＋＋代表出现沉淀线的浓度，如1:8抗体出现中等浓度沉淀线，与1:16、1:32则出现较弱的沉淀线。按表101的互为比例稀释后确定免疫血清的效价为1:32，最佳抗原浓度为1:16。效价在1:8以上即可采用于一般试验。

63 其他鉴定方法

有时，因抗原特殊，沉淀线不易出现，特别是制备的免疫血清将用于某种试验时，则考虑用其它方法（如血凝试验、抑制试验、中和试验、放射免疫技术等）测定其效价。

7 免疫血清的保存

免疫血清保存有三种方法。第一种是4℃保存，将免疫血清清除菌后，液体状态保存于普通冰箱，可以存放3个月到半年，效价高时，一年之内不会影响使用。保存时要加入01％～02％NaN3以防腐。如若加入半量的甘油则保存期可延长。第二种方法是低温保存，放在－20～－40，一般保存5年效价不会有明显下降，但应防止反复冻融，反复冻融几次则效价明显降低。因此低温保存应用小包装，以备取出后在短期内用完。第三种方法是冰冻干燥，最后制品内水分不应高于02％，封装后可以长期保存，一般在冰箱中5～10年内效价不会明显降低。

8 免疫血清中抗体的纯化

单价特异性是指血清只与其特异性抗原发生反应。有时免疫原不纯，含有微量的杂抗原（性质相近的），制得的免疫血清中出现2～3种杂抗体。即使用纯抗原，例如用高度纯化的IgG免疫动物，出现的抗体总是有抗γ重链的抗体，也有抗κ轻链和抗λ轻链的抗体。还有一种情况，有些蛋白质和其他蛋白质处于一种结合状态，如甲胎蛋白常和白蛋白相结合，因此免疫得到的免疫血清总是有抗白蛋白杂抗体存在。

81 除去杂抗体有两种方法：

1．亲和层析法将交叉杂抗原交联到琼脂糖珠4B上，如除去抗白蛋白抗体，则交联上白蛋白或不含甲胎蛋白的血清，装柱后，将预吸收的抗体通过亲和层析柱，杂抗体吸附在柱上，流出液则是单价特异性抗体。

2．吸附剂方法用不含特异性抗原的抗原液，即不含用于免疫动物抗原的其他杂抗原液，如血清、组织液或已知的某种杂抗原，用双功能试剂将其交联，做成固相吸附剂。如用不含甲胎蛋白的血清，稀释1倍后，加入025％的戊二醛或丙酮醛，放冰箱一夜后，该血清成为胶冻状，用力打碎（或用组织粉碎器），用缓冲液多次洗涤后，则成为颗粒状的凝胶吸附剂。用这种吸附剂直接加到免疫血清中（约1/10），抗原则与杂抗体结合，上清液则为无杂抗体的单价特异性抗体。有时因杂抗体太多，必须处理吸收两次才能完全去除。吸附过的凝胶，用3mol/L硫氰酸钾（或钠）洗涤，洗脱掉杂抗体，可再继续使用。

有时杂抗原较少，其他蛋白也少，加入戊二醛后不形成胶冻状，此时可加入无关蛋白进行交联，如牛血清蛋白、兔血清、马血清、卵白蛋白等。加入量以达到含总蛋白的2％～3％为宜。

82 特异性IgG抗体的制备

在标记的免疫测定或其他技术中将特异性抗体纯化出来，是极为重要的。例如在ELISA，用于包被的抗体一定要用特异性IgG，才能得到良好的效果。这是因为全血清中有大量非抗体蛋白，如白蛋白、α1和α2球蛋白等，如不除去，会干扰包被。再如反相间接血凝，致敏红细胞的抗体也需用特异性IgG的I（ab＇）2才能使实验满意。特异性IgG和F（ab＇）2的制备方法有如下几种。

（一）粗提法提取球蛋白

大多用硫酸铵盐析法或硫酸钠盐析法。硫酸铵盐析须经过多次沉淀，第一次用40％饱和度，第二次用35％饱和度，第三次用33％饱和度，经三次提取后的γ球蛋白基本是IgG成分。硫酸钠法更简便，用20％即可将γ球蛋白沉淀出来。经盐析后的γ球蛋白虽大多属于IgG，但还有5％其他区带蛋白，如γ区的杂蛋白。又因IgG组分中还含其他所谓正常的IgG，产生干扰。因此盐析法粗提的γ球蛋白只能用于一般的实验，或者是抗体效价较高的免疫血清。

（二）离子交换层析法提取IgG

常用的离子交换剂有DEAE纤维素或QAE纤维素，以QAESephadex最为理想，DE22、32、52也可应用。取QAESephadexA25或A50经酸处理并在005mol/LpH75～86的磷酸盐缓冲液中平衡，将水分抽干，称湿重Ig加于10ml血清中，在室温30min后，离心或过滤除去离子交换剂。上清液再如此处理一次，即获得较纯的IgG，甚至不含其他杂蛋白。用该技术纯化IgG简便，不损坏抗体，既可小量提取，也可大量制备。

（三）亲和层析法提取特异性IgG

将纯化抗原或粗制抗原（如是单价特异性则对抗原要求不高）交联Sepharose4B制成亲和层析柱，将免疫血清过柱后洗去未结合的杂蛋白，再用硫氰酸钾洗脱，流出的是纯的特异性IgG抗体。因硫氰酸钾对抗体有破坏作用，应及时透析除去。纯化的IgG因含量低，失去保护作用，应及时应用或冻干保存，亦可20℃保存，但皆不理想；加入三乙醇胺或甘油可起保护作用。

（四）酶解法制备F（ab＇）2片段

目录 1 拼音 2 概述 3 标记的免疫技术 4 酶免疫技术的分类 5 酶免疫测定的应用 1 拼音

méi miǎn yì jì shù

2 概述

酶免疫技术是以酶标记的抗体或抗原为主要试剂的方法，是标记免疫技术的一种。近年来标记免疫技术飞速发展，应用不同标记物，根据不同原理、不同技术建立起来的检测方法层出不穷，而方法的创建者往往给同类的方法以不同的名称。因此确知某一方法属于哪一类型，对该方法的正确理解有着重要意义。本节先叙述各种标记免疫技术的要点，然后介绍酶免疫技术的分类，这样可以对酶免疫技术和其他非酶的标记免疫技术的各种类型有一个总的概念。

3 标记的免疫技术

免疫技术是利用抗原抗体反应进行的检测方法，即应用制备好的特异性抗原或抗体作为试剂，以检测标本中的相应抗体或抗原。它的特点是具有高度的特异性和敏感性。如将试剂抗原或试剂抗体用可以微量检测的标记物（例如放射性核素、荧光素、酶等）进行标记，则在与标本中的相应抗体或抗原反应后，可以不必测定抗原抗体复合物本身，而测定复合物中的标记物，通过标记物的放大作用，进一步提高了免疫技术的敏感性。这种标记免疫技术一般分为两类，一类用于组织切片或其他标本中抗原或抗体的定位，另一类用于液体标本中抗原或抗体的测定。前者属于免疫组化技术（immunohistochemicaltechnique）范畴，后者则称为免疫测定（immunoassay）。

首先被用作标记免疫技术中标记物的是荧光素。1941年Coons建立的荧光抗体技术（fluorescentantibodytechnique）使组织和细胞中抗原物质的定位成为可能。放射性核素作为标记物在免疫技术中的应用又开创了特异性的超微量测定。1956年Yalow和Berson建立的放射免疫测定（radioimmunoassay，RIA）很快普遍应用于体液中的激素、微量蛋白及药物的测定。酶用作免疫技术标记物是从抗原定位开始的。1966年Nakene和Pierce利用酶使底物显色的作用而得到与荧光抗体技术相似的结果。70年代初，酶标抗体技术开始应用于免疫测定，其后得到迅速发展。

荧光抗体技术、放射免疫分析和酶免疫技术，即经典的三大标记技术，又可根据标记物是否为放射性物质分为放射性免疫测定和非放射性免疫测定两大类。后者消除了应用放射性物质在测定中带来的不便，受到使用者的欢迎，新的方法不断出现。化学发光免疫技术和金免疫技术等得到很大的发展。这些方法已普遍应用于临床检测验。

4 酶免疫技术的分类

酶免疫技术一般分成酶免疫组化技术和酶免疫测定两大类。酶免疫组化技术与荧光抗体技术相似，酶标记抗体与组织切片上的抗原起反应，然后与酶底物作用，形成有色沉淀物，可以在普通光学显微镜下观察。如酶作用的产物电子密度发生一定的改变，则可用电子显微镜观察，称为酶免疫电镜技术。

酶免疫测定根据抗原抗体反应后是否需要分离结合的与游离的酶标记物而分为均相（homogenous）和异相（heterogenous）两种类型，实际上所有的标记免疫测定均可分成这两类。如以标记抗体检测标本中的抗原为例，按照简单的形式是在试剂抗体过量的情况下进行，其反应式如下：

Ab＋Ag→AbAg＋Ab

AbAg代表结合的标记物，Ab为游离的标记物。如在抗原反应后，先把AbAg与Ab分离，然后测定AbAg或Ab中的标记物的量，从而推算出标本中的抗原量，这种方法称为异相法。如在抗原抗体反应后AbAg中的标记物失去其特性，例如酶失去其活力，荧光物质不显荧光，则不需要进行AbAg与Ab的分离，可以直接测定游离的Ab量，从而推算出标本中的Ag含量，这种方法称为均相法。

在异相法中，抗原和抗体如在液体中反应，分离游离和结合的标记物的方法有好多种。与放射免疫测定相类似的液相异相酶免疫技测定，在某些激素等定量测定中也有应用。但常用的酶免疫测定法为固相酶免疫测定。其特点是将抗原或抗体制成固相制剂，这样在与标本中抗体或抗原反应后，只需经过固相的洗涤，就可以达到抗原抗体复合物与其他物质的分离，大大简化了操作步骤。这种被称为ELISA的检测技术成为目前临床检验中应用较广的免疫测定方法。

综上所述，酶免疫技术的分类可概括如图151。

图151酶免疫技术的分类

5 酶免疫测定的应用

酶免疫测定具有高度的敏感性和特异性，几乎所有的可溶性抗原抗体系统均可用以检测。它的最小可测值达ng甚至pg水平。与放射免疫分析相比，酶免疫测定的优点是标记试剂比较稳定，且无放射性危害。因此，酶免疫测定的应用日新月异，酶免疫测定的新方法、新技术不断发展。但酶免疫测定在医学检验中的普及应归功于商品试剂盒和自动或半自动检测仪器的问世。酶免疫测定步骤复杂，试剂制备困难。只有用符合要求的试剂和标准化的操作，才能获得满意的结果。

商品ELISA试剂盒中应包含包被好的固相载体、酶结合物底物和洗涤液等。先进的试剂盒不仅提供全部试剂成分，而且所有试剂均已配制成应用液，并在各种试剂中加色素，使之呈现不同的颜色。ELISA操作步骤多，所需试剂也多，这种有色试剂既方便操作又有利于减少操作错误。ELISA所有仪器除定量测定中必需的出色仪（专用的称为ELISA测读仪）外，洗涤板也极有用。洗涤机的使用不仅省时省工，而且也利于操作标准化，对中小型实验室是实用且易于接受的。但应注意在采用洗板机前，应先对洗板机的性能加以检定，确认各孔的洗涤效果是否彻底，且重复性好。

半自动和自动化ELISA分析仪亦趋成熟，并在大中型临床检验实验室中取得应用。自动化ELISA分析仪有开放系统（opensystem）和封闭系统（closesystem）两类。前者适用于所有的96孔板的ELISA测定；后者只与特定试剂配套使用。

均相酶免疫测定主要用于药物和小分子物质的检测。ELISA则应用更为广泛，可用以检测的项目包括以下几个方面：

1．病原体及其抗体广泛应用于传染病的诊断。病毒肝炎病毒、风疹病毒、疱疹病毒、轮状病毒等；细菌如链球菌、结核分枝杆菌、幽门螺杆菌和布氏杆菌等；寄生虫如弓形体、阿米巴、疟原虫等。

2．蛋白质各种免疫球蛋白、补体组分、肿瘤标志物（例如甲胎蛋白、癌胚抗原、前列腺特异性抗原等）、各种血浆蛋白质、同工酶（如肌酸激酸MB）、激素（如HGG、FSH、TSH）。

3．非肽类激素如T3、T4、雌激素、皮质醇等。

1 这是检测艾滋的三种方法，分别是酶联免疫吸附法（elisa），金标法，PA是明胶凝集法。

2 你的情况是前两种方法是阴性的，后一种方法没有做。

3待定有两个意思，初筛检测有一定的窗口期，最保守的窗口期是12周，你才50几天所以检测阴性只能是基本排除感染的可能，不能说百分百排除，需要12周在检测一次看看；另一个意思是说初筛实验不能确诊艾滋，也就是说就算是初筛阳性也会给出待确定的结论。

试剂的选择是保证血液检测质量的关键要素虽然国家采用批批检定的形式对ELISA试剂严格把关,但不同厂家的试剂在使用效果上仍存在差异要选购知名度相对高、具有“三证”的试剂,不要用无批号的试剂,最好选用与仪器配套的试剂更不要使用过期的试剂和混用不同批号的试剂

12试剂的准备

在临床实验室,对试剂的准备一般不太注意,通常的做法是在实验时将试剂从冰箱中拿出来即用,而忽略了这种做法有可能影响后面时间不够的问题,其直接的后果是对一些弱阳性标本的检测出现假阴性因此,在ELISA测定中试剂的准备最为关键的是,将试剂盒先从冰箱中拿出来,在室温下放置20～30 min后,再进行测定,使试剂盒在使用前与室温平衡,这样做的目的能使反应微孔内的温度较快地达到所需的温度,以满足后面的测定需求

2 样本的因素

21内源性干扰因素

包括类风湿因子、补体、高浓度的非特异免疫球蛋白、异嗜性抗体、某些自身抗体等[1]

211类风湿因子在类风湿患者及正常人血清中,常含有较高或不同浓度的类风湿因子(RF),其一般为IgM型,亦有IgG和IgA型,具有与变性IgG产生非特异结合的特点,因为在ELISA测定中,其可与固相上包被的特异抗体IgG以及随后加入的酶标的特异抗体IgG结合,从而出现假阳性结果避免其发生的方法有:①用F(ab)2替代完整的IgG②标本用联有热变性IgG的固相吸附剂处理③检测抗原时,可用2-巯基乙醇加入到标本稀释液中使RF降解

212补体在固相酶免疫测定中,来自哺乳动物的固相抗体和酶标二抗均有激活人补体系统的功能一方面,固相抗体和酶标二抗可因其吸附及结合过程中抗体分子发生变构,使Fc段的补体C1q结合点暴露出来,使C1q成为一个中介物将二者交联起来出现假阳性结果另一方面,固相抗体也会因为活化补体的结合,封闭抗体和抗原的表位结合能力而引起假阴性解决的办法是:①用EDTA稀释标本②56℃ 30 min加热血清使C1q灭活[1,2]

22外源性干扰因素

包括标本溶血、标本被细菌污染、标本保存时间过长和标本凝固不全等

221标本的溶血血红蛋白中含铁血红素有类过氧化物酶的活性,因此,在以辣根过氧化物酶(HRP)为标志的ELISA测定中,如血清样本中血红蛋白浓度较高,则很容易在温育过程中吸附于固相,从而与后面加入的HRP底物反应显色所以在采血时应注意手法,采集的血液勿用力振荡,严防标本溶血

222标本的污染菌体可能含有内源性辣根过氧化物酶,可使实验出现非特异性显色因此,ELISA检测宜采集新鲜标本,如不能当时测定,5 d之内应4℃保存,1周后检测应低温冻存;同时,收集标本采用无菌试管,可防止标本的污染

223标本的保存标本在冰箱中保存过久,血清中IgG可聚合成多聚体,AFP可形成二聚体,在用间接法测定中会导致本底过深,甚至造成假阳性冰冻保存的标本反复冻融产生机械剪切力对标本中的蛋白等分子有破坏作用,可引起假阴性结果因此,ELISA检测尽量采用新鲜标本,长时冻存的样本避免反复融冻[3]

224标本凝固不全凝固不全的血清中含有部分纤维蛋白原,可使结果呈假阳性解决的方法有:①于采血管中加入适当的抗凝剂;②将采集后的血液放在架子上再放入37℃水浴中1 h,待充分凝固后再离心分离血清[4]

内源性干扰因素一般包括类风湿因子、补体、高浓度的非特异免疫球蛋白 、异嗜性抗体、某些自身抗体、因使用鼠抗体治疗或诊断诱导的抗鼠Ig抗体、交叉反应物质等。在日常的临床血清(浆)标本中，有相当比例不同程度的含有上述各种干扰物质，从而导致测定结果的假阳性。

1类风湿因子(rheumatoid factors,RF)在类风湿患者、其他疾病以及正常人血清中,常含有较高或不同浓度的RF，RF一般为TgM型，亦有IgG和IgA型，RF具有与变性IgG产生非特异结合的特点，因为在ELISA测定中，其可与固相上包被的特异抗体IgG以及随后加入的酶标的特异抗体IgG结合，从而出现假阳性结果。尤其是在捕获法IgM型特异抗体的测定中表现最为明显，因为此时固相包被的抗体为抗人弘链抗体，IgM型RF的存在可使其大量结合于固相。为避免RF对ELISA测定的干扰，通常可以采取下述措施：

(1)稀释标本：这在判断急性病原体感染的特异IgM抗体如抗HAVIgM，抗HBclgM， TORCH的IgM抗体检验等尤为有用。因为急性感染时，血循环中特异的IgM抗体滴度通常很高，而RF滴度通常相对要低得多。因此，在测定前对标本进行稀释，特异的IgM因高滴度存在仍可检出，而非特异的RF则会因为稀释变成非常低的滴度，从而对测定几乎不产生干扰。现在，有些特异IgM检测ELISA试剂 盒不要求稀释标本，直接检测，这样虽然方便了实验室技术人员的操作，但容易出现假阳性结果，并且由于某些慢性感染，如HBV的感染，血循环中抗HBelgM可持续以一定的滴度存在，标本不做稀释即进行检测，即可出现阳性结果，从而失去抗HBclgM用于HBV急性感染的诊断价值。因此，在临床实验室，一定要使用要求对标本做1:1000稀释的试剂盒进行检验，从而保证相应检测项目结果的可靠性及临床应用价值。

(2)改变酶标抗体：由于RF结合的是IgG的Fc片段，如果将待酶标的抗体的F，片段酶切夫除，仅留下具有特异结合功能的F(ab’)2部分标记酶，则在测定中即可避免RF的干扰。

(3)标本中RF用变性IgG预先封闭：将经热变性(63℃，10min)的动物如兔、羊等的IgG加入到标本稀释液中，或是将该变性IgG连接至一颗粒固相如聚苯乙烯微球或微孔，然后加入临床血清标本，反应后，再吸出标本进行检测。此外，在测定特异IgM时，也可使用抗人IgG去除临床标本中RF和IgG。

(4)测定抗原 时，可在标本中加入可使RF降解的还原剂：如2—巯基乙醇。2—巯基乙醇等还原剂可使抗体内的巯基裂解，因而可以去除RF的干扰，但只适用于抗原测定。

(5)包被或酶标二抗使用特异的鸡抗体IgY：RF不与鸡IgY反应，如果包被和酶标二抗均为鸡IgY抗体，则不受标本中RF的干扰。

2补体在固相酶免疫测定中，来自哺乳动物的固相特异抗体和酶标二抗均有激活人补体系统的功能。一方面，固相抗体和酶标二抗可因为其在固相吸附及结合过程中，抗体分子发生变构，从而其F, 段的补体C1，结合位点被暴露出来，这样C1，就成为一个中介物将二者交联起来，从而出现假阳性结果。另一方面，固相抗体也会因为活化补体的结合，封闭抗体的抗原表位结合能力，而引起假阳性结果或使定量测定结果偏低。由补体引起的干扰可通过下述方法避免：

(1)对临床血清标本加热灭活补体：采用56~C30min加热可使标本中的补体C1。灭活。

(2)包被或酶标二抗使用特异的鸡抗体：鸡抗体不激活人的补体系统，因此，使用特异的鸡抗体，不会出现因补体激活而存在的假阳性和假阴性干扰。

3异嗜性抗体(heterophilieantibodies)人类血清中含有抗啮齿类动物(如鼠、马、羊等)的免疫球蛋白(lg)的抗体，即天然的异嗜性抗体。有研究表明，天然的异嗜性抗体(lgG)可分为两类，一类(85%的假阳性由其引起)可结合于山羊、小鼠、大鼠、马和牛IgG的Fab区域，但不与兔IgG的Fab区结合。另一类(15%的假阳性由其引起)可结合于小鼠、马、牛和兔IgG的Fc区表位，但不与山羊和大鼠IgG的Pc区表位结合。异嗜性抗体可通过交联固相和酶标的单抗或多抗而出现假阳性反应。由异嗜性抗体引起的干扰可通过下述方法避免：

(1)使用特异的兔F(ab’)2。片段作为固相或测定酶标抗体。

(2)在标本或标本稀释液中加入过量的动物Ig，封闭可能存在的异嗜性抗体。但加入量不足或亚类不同时无效。

(3)使用靶特异的非Ig亲和蛋白(affibody)替代固相或酶标抗体之一。采用噬菌展示来自单个金**葡萄球A蛋白(SPA)联合文库的人IgA结合亲和蛋白，用于IgA的测定，不受异嗜性抗体的影响。

4因使用鼠抗体治疗或诊断诱导的抗鼠Ig抗体在临床上，有尝试使用鼠源性单克隆抗体进行靶向治疗，及使用放射性核索标记鼠源性单克隆抗体进行影像诊断等，均有可能