什么是革兰氏染色法？主要步骤是？关键步骤？

一、革兰氏染色法

不少于两种染料参与的染色方法称之为复染法，革兰氏染色法属于复染法类的一种染色方法。由结晶紫、碘液、番红参与，通过染料对细菌的细胞壁的着色，来区分革兰氏阴性菌与阳性菌的一种方法。

二、主要步骤及关键步骤

（1）制片。

取菌种培养物常规涂片、干燥、固定。

要用活跃生长期的幼培养物作革兰氏染色；涂片不宜过厚，以免脱色不完全造成假阳性；火焰固定不宜过热（以玻片不烫手为宜）。

（2）初染。

滴加结晶紫（以刚好将菌膜覆盖为宜）染色1-2min，水洗。

（3）媒染。

用碘液冲去残水，并用碘液覆盖约1min，水洗。

（4）脱色。

用滤纸吸去玻片上的残水，将玻片倾斜，在白色背景下，用滴管流加95%的乙醇脱色，直至流出的乙醇无紫色时，立即水洗。

乙醇脱色是革兰氏染色操作的关键环节：脱色不足，阴性菌被误染成阳性菌；脱色过度，阳性菌被误染成阴性菌。因而脱色时间一般为20-30s。

（5）复染。

用番红液复染约2min，水洗。

（6）镜检。

干燥后，用油镜观察。菌体被染成蓝紫色的是革兰氏阳性菌，被染成红色的为革兰氏阴性菌。

扩展资料：

革兰氏染色的原理

结晶紫（C25H30ClN3）当中的CL-与I-发生氧化还原反应生成不溶于水的蓝紫色复合物（C25H30lN3）。

革兰氏阳性菌细胞壁较厚且肽聚糖网层次多而交联致密，进行脱色时，因失水反而使网孔缩小，再加上结构中不含类脂，所以脱色处理不会出现缝隙，因此能把结晶紫与碘复合物牢牢留在壁内。

而革兰氏阴性菌因其细胞壁薄、外膜层类脂含量高、肽聚糖层薄且交联度差，在遇脱色剂后，以类脂为主的外膜迅速溶解，薄而松散的肽聚糖网不能阻挡结晶紫与碘复合物的溶出，因此通过脱色处理后后仍呈无色状态，再经沙黄等红色染料复染，就使革兰氏阴性菌呈红色。

——革兰氏染色法

革兰氏染色是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法，通过结晶紫初染和碘液媒染后，在细胞壁内形成了不溶于水的结晶紫与碘的复合物，革兰氏阳性菌由于其细胞壁较厚、肽聚糖网层次较多且交联致密，革兰氏染色属复染法，即将标本固定后，先用龙胆紫染色，加碘液媒染后用酒精脱色，再用蕃红复染。

革兰氏染色最为关键的步骤就是脱色，可以说脱色决定了革兰氏染色的成败。虽说革兰氏阳性菌不容易脱色，但如果脱色时间过长，革兰氏阳性菌依然会被脱去颜色而被误认为阴性菌，这对细菌鉴定判读会造成极其重大的影响。因此，脱色必须把握时间，不同标本的脱色时间也应该灵活掌握，这需要深厚的经验来把握才能染出优秀的片子。一般来说，脱色脱至恰好没有看得见的紫色脱下为最佳停止脱色的时机。

革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法，1884年由丹麦医师Gram创立

细菌先经碱性染料结晶染色，而经碘液媒染后，用酒精脱色，在一定条件下有的细菌此色不被脱去，有的可被脱去，因此可把细菌分为两大类，前者叫做革兰氏阳性菌（G+），后者为革兰氏阴性菌（G—）。为观察方便，脱色后再用一种红色染料如碱性蕃红等进行复染。阳性菌仍带紫色，阴性菌则被染上红色。有芽胞的杆菌和绝大多数和球菌，以及所有的放线菌和真菌都呈革兰氏正反应；弧菌，螺旋体和大多数致病性的无芽胞杆菌都呈现负反应。

[原理]：革兰氏染色目前有三种观点：等电点学说、化学学说和渗透学说。

1． 等电点学说，革兰氏阳性菌的等电点在PH2-3，比阴性菌（PH4-5）低，加之碘为弱氧化剂，可降低革兰氏阳性菌的等电点，致使两类菌的等电点差异扩大，因此阳性菌和碱性染料的结合力比阴性菌更强。

2．化学学说，碘液在菌体内与结晶紫结合后又和菌体内核糖核酸镁盐-蛋白质复合物结合，此结合物不易被丙酮酒精脱掉，呈革兰氏染色阳性。因革兰氏阴性菌缺乏核糖核酸镁盐，故对碘与结晶紫结合物摄取少，且不牢固，易被丙酮酒精脱色而呈革兰氏染色阴性。

3．渗透学说，乙醇使阳性菌所含粘肽多糖脱水而致细胞壁间隙缩小，通透性降低，在菌体内保留了染料-碘复合物，呈紫色。阴性菌含粘肽少，细胞壁变化不大，通透性不受影响，菌体内的染料-碘复合物较易透出，失去紫色，被复染成为红色。

[试剂]：Crystal violet(结晶紫)、Gram Iodine(碘液)、Decolourizer（丙酮酒精）、Safranin（稀释沙黄）

[操作]：

1．标本处理：（1）有菌部位的标本，如痰液、粪便、各种拭子、创面等可直接涂片。

（2）无菌部位的标本，如脑脊液、胸水、腹水、胆汁、尿液、关节液等，应取适量标本（最高可达5-7ml）,经3000rpm 离心10min，取沉渣涂片染色。

2．涂片制作：菌液涂片时，用接种环沾取菌液点在载玻片上，标本可直接在玻片上涂布；菌落涂片时，先取生理盐水一滴，置玻片上，用接种针挑取菌落在盐水中涂布。制作的涂片应自然干燥，并经火焰固定，固定的温度不宜过高，以玻片背面接触手背不烫为准，否则可能使细菌形态改变。将固定后的涂片进行染色。

3． 染色方法：

（1）加上Crystal violet(结晶紫)后，染色3-5秒或更久，之后用自来水冲洗之。

（2）加上Gram Iodine(碘液)后染色3-5秒或更久，之后用自来水冲洗之。

（3）以Decolourizer（丙酮酒精）脱色约5-10秒，并用自来水冲洗之。

（4）加上Safranin（稀释沙黄）后，染色3-5秒或更久，之后用自来水冲洗之。

（5）吸干或在空气中凉干后，置油镜镜检。

4．结果观察：紫色为革兰氏阳性，红色为革兰氏阴性。

[报告方式]：革兰氏染色：检出革兰氏阳性球菌 ；革兰氏阴性球菌

检出革兰氏阳性杆菌 ；革兰氏阴性杆菌

[注意事项]：

1．标本涂片不能太厚，严格按操作要求进行。

2．玻片通过火焰温度不能太高。

3．若涂片较厚，应延长脱色时间，直至不在出现紫色为止。

[临床意义]：通过革兰氏染色，将细菌分为革兰氏阳性和革兰氏阴性，便于临床治疗。

[附]

1 沙黄（番红）Safranine T [C20H19ClN4=35085]

红棕色粉末；碱基性染料。在水中溶解，在乙醇中易溶。

2 碘液配制：001mol/l碘液——称取13g碘，置于50mol烧杯中，加入25g碘化钾及25毫升蒸馏水，不断搅拌之，使其溶解均匀。再加02mol浓盐酸(体积质量119g/cm3)，再加蒸馏水稀释到1000mol。溶液应贮藏在棕色试剂瓶中，储于低温暗橱内。有效期为一个月左右

革兰氏阴性菌，以[大肠杆菌]为代表。大肠杆菌为兼气性菌种，一般生存於肠道中及厌氧的还境中。革兰氏阴性菌细胞壁的特徵为有一层out member 与阳性菌种不同。目前对大肠杆菌的研究很多，除了它是一般食物中是否有被污染的指标外，很多分子生物学方面的研究皆需要使用到大肠杆菌当作实验宿主。

　　橙子是深受人们喜爱的水果之一，但市场经常会出现很多经过染色的橙子，所以消费者在选购橙子时，一定要看仔细了。以下是我收集整理的关于鉴别染色橙子的方法，希望对你有帮助。

鉴别染色橙子的方法

1、染色橙子经常带有一股化学物的 味道，没染色的橙子闻起来有股淡淡的清香。

2、染过色的橙子，表面看起来特别红艳，仔细观察，可发现表皮皮孔有红色斑点，一些橙表面甚至有红色残留物。

3、染色严重的橙子，橙蒂也会变成红色;没染色的橙，橙蒂是白绿相间的。

　　4、染过色的橙子，表面摸起来黏黏的;没染色的橙，摸起来比较自然。

5、用溼巾擦拭橙子表面，如果溼巾变红，说明橙子可能被染色;没染色的橙子，溼巾擦拭后只能看到淡淡的**。

橙子的营养价值

橙子中含大量维生素C，且易于吸收，膳食中缺乏维生素C，可阻碍神经细管向大脑输送营养成分的功能，从而使大脑不能及时得到营养成分。

1、 橙子含有大量维生素C和胡萝卜素，可以抑制致癌物质的形成，还能软化和保护血管，促进血液回圈，降低胆固醇和血脂;

2、研究显示，每天喝3杯橙汁可以增加体内高密度脂蛋白HDL的含量，从而降低患心脏病的可能，橙汁内含有一种特定的化学成分即类黄酮和柠檬素，可以促进HDL增加，并运送低密度脂蛋白LDL到体外;

3、 经常食用橙子对预防胆囊疾病有效;

4、橙子发出的气味有利于缓解人们的心理压力，但仅有助于女性克服紧张情绪。

橙子的功效与作用

1、和胃降逆，橙子味酸，性寒凉，入肝、胃经。有和中开胃，降逆止呕之功。善用于饮食停滞而引起的呕吐，胃中浮风恶气，肝胃郁热等疾病。

2、宽胸开结，橙子性寒，有清热降逆之功、善清肺胸之热，由于肺中蕴热，或外感风热，热灼津液为痰，痰热结于胸中，气机痹阻，引起胸部疼痛，咳喘，咯痰黄稠，甚则咳血，或痰腥臭，烦闷发热，苔黄腻，脉象滑数，治宜用橙子，泄热涤痰，宽胸开结，凉血止血，功效显著。

3、消瘿，因外邪所侵，或情志内伤，以及体质虚弱，使气机阻滞，津液积聚为痰。

如《丹溪心法》：“痰之为物，随气升降，无处不到。”“凡人身上、中、下有块者，多是痰。”故瘿自发生和痰凝有一定的内在联络。如痰凝结于喉结两侧为肉瘿。其症喉结两侧肿块在于皮里膜外，区域性不红不热，按之坚实或有囊性感，舌苔薄腻，脉滑，治宜用橙子清热化痰，解郁散结。

4、鉴别应用， 橙子与橙子核，一为橙子肉，一是橙核，肉偏于止呕恶，宽胸膈，消瘿，鲜鱼蟹之毒。而橙子核偏于治疝气，诸淋病，腰痛，外用可治面黔粉刺，橙子偏于治肝肺之病，而橙核偏于治肾脏之患。

革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法，这种染色法是由一位丹麦医生汉斯·克里斯蒂安·革兰（Hans Christian Gram，1853年－1938年）于1884年所发明，最初是用来鉴别肺炎球菌与克雷白氏肺炎菌之间的关系。

未经染色之细菌，由于其与周围环境折光率差别甚小，故在显微镜下极难观察。染色后细菌与环境形成鲜明对比，可以清楚地观察到细菌的形态、排列及某些结构特征，而用以分类鉴定。

根据细菌的革兰氏染色性质，可以缩小鉴定范围，有利于进一步分离鉴定，以对疾病做出诊断。

步骤

革兰氏染色法一般包括初染、媒染、脱色、复染等四个步骤，具体操作方法是：

1）涂片固定。

2）草酸铵结晶紫染1分钟。

3）自来水冲洗。

4）加碘液覆盖涂面染约1分钟。

5）水洗，用吸水纸吸去水分。

6）加95%酒精数滴，并轻轻摇动进行脱色，20秒后水洗，吸去水分。

7）蕃红染色液（稀）染1分钟后，自来水冲洗。干燥，镜检。

原理

通过结晶紫初染和碘液媒染后，在细胞壁内形成了不溶于水的结晶紫与碘的复合物，革兰氏阳性菌由于其细胞壁较厚、肽聚糖网层次较多且交联致密，故遇乙醇或丙酮脱色处理时，因失水反而使网孔缩小，再加上它不含类脂，故乙醇处理不会出现缝隙，，因此能把结晶紫与碘复合物牢牢留在壁内，使其仍呈紫色；而革兰氏阴性菌因其细胞壁薄、外膜层类脂含量高、肽聚糖层薄且交联度差，在遇脱色剂后，以类脂为主的外膜迅速溶解，薄而松散的肽聚糖网不能阻挡结晶紫与碘复合物的溶出，因此通过乙醇脱色后仍呈无色，再经沙黄等红色染料复染，就使革兰氏阴性菌呈红色。

染色的差异主要是由于阴性与阳性细菌细胞壁的差异所引起的。

①革兰氏阳性细菌的细胞壁

G+细菌细胞壁具有较厚（20-80nm）而致密的肽聚糖层，多达50层，占细胞壁成分的40%～95%，它同细胞膜的外层紧密相连（图2-9）。有的G+细菌细胞壁中含有磷壁酸（teichoic-acid），也称胞壁质（murein），它是甘油和核糖醇的聚合物，磷壁酸通常以糖或氨基酸的酯而存在。由于磷壁酸带负电荷，它在细胞表面能调节阳离子浓度。磷壁酸与细胞生长有关，细胞生长中有自溶素（autolysins）酶类起作用，磷壁酸对自溶素有调节功能，阻止胞壁过度降解和壁溶。

如果细胞壁的肽聚糖层被消溶，G+细胞成为原生质体（protoplasts），细胞壁不复存在，而只存留细胞膜。除链球菌外，大多数G+细菌细胞壁中含极少蛋白质。

②革兰氏阴性细菌的细胞壁 G—细菌细胞壁比G+细菌细胞壁薄（15～20nm）而结构较复杂，分外膜（outer membrane）和肽聚糖层（2～3nm）（图2-10）。在细胞壁和细胞质膜之间有一个明显的空间，称为壁膜间隙（periplasmic space）。

外膜 G—细菌细胞壁外膜的基本成分是脂多糖（lipopolysaccharide,LPS），它同细胞质膜相同之处也是双层类脂，但除磷脂外还含有多糖和蛋白质。

LPS的多糖部分包括核心多糖和O-特异多糖。O-特异多糖由重复分支的碳水化合物分子组成，含有已糖（葡萄糖、半乳糖和鼠李糖）和二脱氧已糖。由于糖的种类不同，使各种G—细胞具有不同特性的LPS。核心多糖（core polysaccharide）的主要组分是酮脱氧辛酸（ketodeoxyoctonate, KDO）。

外膜中还含有几种蛋白，如脂蛋白、通透蛋白。有些蛋白具有通孔作用（porin），调控外界分子进入细胞；有的蛋白分子可以作为噬菌体的受体；许多G—细菌对高等生物有致病性是由LPS的成分决定的，它的毒性组分常称为内毒素（endotoxins）。

肽聚糖层 G—细菌细胞壁的肽聚糖层很薄，在大肠杆菌和其它细菌中仅有单

层。肽聚糖层和外膜的内层之间通过脂蛋白连接起来。

壁膜间隙 G—细菌细胞壁的外膜与细胞质膜之间存在明显的壁膜间隙，一层薄的肽聚糖处于其间，肽聚糖层和细胞质膜之间的间隙较宽，肽聚糖层至外膜之间的间隙较窄。大肠杆菌的壁膜间隙宽度为12～15nm，呈胶胨态。其间含有三类蛋白质：水解酶，催化食物的初步降解；结合蛋白，启动物质转运过程；化学受体（chemoreceptors），在趋化性中起作用的蛋白。

1、揉搓干茶。将干茶放在指尖揉搓，如果手上会有颜色或粉剂样物质，则可能是染色茶。

2、观察毫毛。有的茶叶品种有明显的毫毛，可以观察毫毛颜色，茶叶毫毛通常为白色，如果毫毛是绿色，则可能是染色茶。

3、看茶渍。泡完茶后先不洗杯，观察形成的茶渍，一般茶渍呈浅黄、深黄、橘黄等偏黄偏褐色。如果是浅绿、墨绿、草绿等奇怪颜色，则可能是染色茶。

4、想要买到不染色的好茶，可以到待客九品这里预定的，茶树下放养跑山鸡，虫害较少，严格控制质量。

这里提到的染色翡翠，没什么特殊情况的话就是针对那些结晶颗粒较粗，裂隙较发育，且颜色浅的翡翠，人们会用氨基染料、铬酸盐以及紫色、绿色抛光粉等对其染色，使得翡翠的颜色得到加深，所以染色翡翠鉴定就要从颜色下手。因此，通过颜色是有望分辨出翡翠真假来的。

假设有一个染色的假翡翠手镯，其在透射光下染色翡翠手镯的局部，可见染料密集分布的情况；且染色翡翠中的绿色染剂沿裂隙呈细丝状分布，只要你利用显微镜放大观察到的酸洗充胶染色翡翠的内部特征：颜色大多不自然，显得呆板；且比天然翡翠的颜色要艳丽，没有色根；看起来颜色发飘，有种虚的感觉。

其实，根据染色翡翠的特征，是可以看得出其与纯天然翡翠的区别的。而接下来，继续给大家介绍鉴别染色翡翠的方法：

1、借助放大镜

用来观察翡翠的裂隙或者是其颗粒间隙。因为染色处理是将染色剂沁入结晶颗粒较粗或裂隙较发育的翡翠中的，所以染色剂就会存在于翡翠的裂隙或颗粒之间，那么放大检查翡翠的表面，就会看到裂隙或颗粒间隙中有染料沉积物分布，这是染色翡翠鉴定最直接的证据。

2、白炽灯下查询

将翡翠置于白炽灯下查询，如果颜色实际的是赤色，那阐明是人工染色；如果颜色不变红，则有两种可能：天然色或染色，此刻需求凭仗其他办法进一步断定。

3、紫外线荧光灯

天然的紫色翡翠，在紫外线荧光灯的照耀下一般没有荧光反响，而被染色紫罗兰翡翠在紫外灯光下，常有较明显的荧光。

4、查氏滤色镜区别

辐照改色的翡翠，其绿色仅在表面，呈环带状或斑块状分布，这样的C货翡翠在查氏镜下呈紫赤色。用辐照改色的翡翠，虽透明度好，但翠里透蓝，玉件表面有被轰击的痕迹，受轰击处与未受轰击处比较，前者表面色深。