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限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）:识别并切割特异的双链DNA序列的一种内切核酸酶
[别名] Endodeoxyribonuclease
[酶反应] 限制性内切酶能分裂DNA分子在一限定数目的专一部位上它能识别外源DNA并将其降解
[单位定义] 在指明pH与37℃,在005mL反应混合物中,1小时消化1μg的λDNA的酶量为1单位
[性状] 制品不含非专一的核酸水解酶(由10单位内切酶与1μg λDNA,保温16小时所得的凝胶电泳图谱的稳定性表示)
限制性核酸内切酶的命名；一般是以微生物属名的第一个字母和种名的前两个字母组成,第四个字母表示菌株(品系)例如,从Bacillus amylolique faciens H中提取的限制性内切酶称为Bam H,在同一品系细菌中得到的识别不同碱基顺序的几种不同特异性的酶,可以编成不同的号,如HindII、HindIII,HpaI、HpaII,MboI、MboI等
在生物体内有一类酶,它们能将外来的DNA切断,即能够限制异源DNA的侵入并使之失去活力,但对自己的DNA却无损害作用,这样可以保护细胞原有的遗传信息由于这种切割作用是在DNA分子内部进行的,故名限制性内切酶(简称限制酶)限制酶是基因工程中所用的重要切割工具科学家已从原核生物中分离出了许多种限制酶,并且已经商品化,在基因工程中广泛使用根据限制酶切割的特点,可将它们分为两大类：一类是切割部位无特异性的；另一类是可特异性地识别核苷酸序列,即只能在一定的DNA序列上进行切割这种能被特异性识别的切割部位都具有回文序列,也就是在切割部位,一条链正向读的碱基顺序与另一条链反向读的顺序完全一致在基因工程中使用的多数是后一类酶限制酶在特定切割部位进行切割时,按照切割的方式,又可以分为错位切和平切两种错位切一般是在两条链的不同部位切割,中间相隔几个核苷酸,切下后的两端形成一种回文式的单链末端,这个末端能与具有互补碱基的目的基因的DNA片段连结,故称为黏性末端这种酶在基因工程中应用最多另一种是在两条链的特定序列的相同部位切割,形成一个无黏性末端的平口
在基因操作过程中,除了限制酶以外,还要用一系列的酶类,才能完成全过程例如,碱性磷酸酯酶、DNA多聚酶、末端转移酶、多核苷酸酶、逆转录酶等这些酶都有各自特殊的催化功能,现在都有商品出售,可以根据不同的需要选用
简短定义：
DNA限制性内切酶：
生物体内能识别并切割特异的双链DNA序列的一种内切核酸酶它可以将外来的DNA切断的酶,即能够限制异源DNA的侵入并使之失去活力,但对自己的DNA却无损害作用,这样可以保护细胞原有的遗传信息由于这种切割作用是在DNA分子内部进行的,故名限制性内切酶(简称限制酶)
限 制 性 内 切 酶 综 述
(Restriction Endonucleases: An Overview)
30多年前,当人们在对噬菌体的宿主特异性的限制-修饰现象进行研究时,首次发现了限制性内切酶细菌可以抵御新病毒的入侵,而这种"限制"病毒生存的办法则可归功于细胞内部可摧毁外源DNA的限制性内切酶首批被发现的限制性内切酶包括来源于大肠杆菌的EcoR I和EcoR II,以及来源于Haemophilus influenzae的Hind II和Hind III这些酶可在特定位点切开DNA,产生可体外连接的基因片段研究者很快发现内切酶是研究基因组成、功能及表达非常有用的工具
当限制性内切酶的应用在上世纪七十年代流传开来的时候,以NEB为代表的许多公司开始寻找更多的限制性内切酶除了某些病毒以外,限制性内切酶只在原核生物中被发现人们正在从数以千计的细菌及古细菌中寻找新的限制性内切酶而对已测序的原核基因组数据分析表明,限制性内切酶在原核生物中普遍存在--所有自由生存的细菌和古细菌似乎都能编码限制性内切酶
限制性内切酶的形式多样,从大小上来说,它们可以小到如Pvu II（157个氨基酸）,也可以比1250个氨基酸的Cje I更大在已纯化分类的3000种限制性内切酶中,已发现了超过250种的特异识别序列其中有30%是在NEB发现的对具有未知特异识别序列的限制性内切酶的研究发现工作仍在继续人们从分析细胞提取物的生化角度研究的同时,也采用计算机分析已知的基因组数据,以期有更多的发现尽管很多新发现的酶的识别序列与已有的重复--即同裂酶,仍然有识别新位点的酶不断被发现
上世纪80年代,NEB开始克隆并表达限制性内切酶克隆技术由于将限制性内切酶的表达与原有细胞环境分离开来,避免了原细胞中其它内切酶的污染,从而提高了酶的纯度此外,克隆技术提高了限制性内切酶的产量,简化了纯化过程,使得生产成本显著降低；克隆的基因很容易进行测序分析,表达出的蛋白也能进行X射线结晶分析,这使得我们对于克隆产物更加确定
限制性内切酶 一、限制与修饰（Restriction and modification）
1．限制与修饰现象
早在 50 年代初,有许多学者发现了限制与修饰现象,当时称作寄主控制的专一性（host controlled specificity） l 噬菌体表现的现象便具有代表性和普遍性,其在不同宿主中的转染频率可说明这一问题（表 2-1） l 在感染某一宿主后,再去感染其它宿主时会受到限制
Ecoli 菌株 λ噬菌体感染率
lK lB lC
Ecoli K 1 10-4 10-4
Ecoli B 10-4 1 10-4
Ecoli C 1 1 1
说明 K 和 B 菌株中存在一种限制系统,可排除外来的 DNA 10-4 的存活率是由宿主修饰系统作用的结果,此时限制系统还未起作用而在 C 菌株不能限制来自 K 和 B 菌株的 DNA 限制作用实际就是限制酶降解外源 DNA ,维护宿主遗传稳定的保护机制甲基化是常见的修饰作用,可使腺嘌呤 A 成为 N6 甲基-腺膘呤,胞嘧啶 C 成为 5' 甲基胞嘧啶通过甲基化作用达到识别自身遗传物质和外来遗传物质的目的
2．限制酶的发现
在 20 世纪 60 年代,人们就注意到 DNA 在感染宿主后会被降解的现象,从而提出限制性切酶和限制酶的概念 1968 年,首次从 Ecoli K 中分离到限制酶,它有特定的识别位点但没有特定的切割位点,其中切割位点离识别位点达 1000bp 以上
1970 年,美国约翰·霍布金斯大学的 H Smith 于偶然中发现,流感嗜血杆菌 （Haemophilus influenzae）能迅速降解外源的噬菌体 DNA ,其细胞提取液可降解 Ecoli DNA ,但不能降解自身 DNA ,从而找到 HindⅡ 限制性内切酶 HindⅡ 限制性内切酶位点和切割位点如下：
5 '… GTPy ↓ PuAC … 3 '
3 '… CAPu ↑ PyTG … 5 '
从此以后,发现的限制酶越来越多,并且许多已经在实践中得到应用 EcoRⅠ 是应用最广泛的限制性内切酶,酶切位点和切割位点如下：
5' G↓AATTC 3'
3' CTTAA↑G 5'
限制性内切酶的命名遵循一定的原则,主要依据来源来定,涉及宿主的种名、菌株号或生物型命名时,依次取宿主属名第一字母,种名头两个字母,菌株号,然后再加上序号（罗马字）如 HindⅢ 限制性内切酶, Hin 指来源于流感嗜血杆菌, d 表示来自菌株 Rd , Ⅲ 表示序号以前在限制性内切酶和修饰酶前加 R 或 M ,且菌株号和序号小写但现在限制性内切酶名称中的 R 省略不写
1986 年下半年发现 615 种限制酶和 98 种甲基化酶； 1998 年发现 10000 种细菌或古细菌中存在 3000 种酶,且酶有 200 多种特异性到 2005 年 1 月,共发现 4342 种限制酶和甲基化酶,其中限制酶有 3681 种,包括 Ⅰ 型、 Ⅱ 型、 Ⅲ 型限制酶各有 59 、3612 、10 种,甲基化指导的限制酶有 3 种,商业化的限制酶有 588 种,在 Ⅱ 型限制酶中共有 221 种特异性
3．限制与修饰系统的种类
根据酶的亚单位组成、识别序列的种类和是否需要辅助因子,限制与修饰系统至少可分为四类表 2-2 是各种限制与修饰系统的比较
Ⅱ 型（type Ⅱ）限制与修饰系统所占的比例最大,达 93% Ⅱ 型酶相对来说最简单,它们识别回文对称序列,在回文序列内部或附近切割 DNA ,产生带 3'- 羟基和 5'- 磷酸基团的 DNA 产物,需 Mg2+ 的存在才能发挥活性,相应的修饰酶只需 SAM 识别序列主要为 4-6bp ,或更长且呈二重对称的特殊序列,但有少数酶识别更长的序列或简并序列,切割位置因酶而异,有些是隔开的
Ⅱs 型（type Ⅱs）限制与修饰系统,占 5% ,与 Ⅱ 型具有相似的辅因子要求,但识别位点是非对称,也是非间断的,长度为 4-7bp ,切割位点可能在识别位点一侧的 20bp 范围内
Ⅱ 型限制酶一般是同源二聚体（homodimer）,由两个彼此按相反方向结合在一起的相同亚单位组成,每个亚单位作用在 DNA 链的两个互补位点上修饰酶是单体,修饰作用一般由两个甲基转移酶来完成,分别作用于其中一条链,但甲基化的碱基在两条链上是不同的
在 Ⅱ 型限制酶中还有一类特殊的类型,该酶只切割双链 DNA 中的一条链,造成一个切口,这类限制酶也称切口酶 （nicking enzyme）,如 NBst NBI
Ⅰ 型（type Ⅰ）限制与修饰系统的种类很少,只占 1% ,如 EcoK 和 EcoB 其限制酶和甲基化酶 （即 R 亚基和 M 亚基） 各作为一个亚基存在于酶分子中,另外还有负责识别 DNA 序列的 S 亚基,分别由 hsdR 、hsdM 和 hsdS 基因编码,属于同一操纵子（转录单位） EcoK 编码基因的结构为 R2M2S EcoB 编码基因的结构为 R2M4S2
EcoB 酶的识别位点如下,其中两条链中的 A 为甲基化位点, N 表示任意碱基
TGA（N）8TGCT
EcoK 酶的识别位点如下,其中两条链中的 A 为可能的甲基化位点
AA°C（N）6GTGC
但是 EcoB 酶和 EcoK 酶的切割位点在识别位点 1000bp 以外,且无特异性
Ⅲ 型（type Ⅲ）限制与修饰系统的种类更少,所占比例不到 1% ,如 EcoP1 和 EcoP15 它们的识别位点分别是 AGACC 和 CAGCAG ,切割位点则在下游 24-26bp 处
在基因操作中,一般所说的限制酶或修饰酶,除非特指,均指 Ⅱ 型系统中的种类
表2-2：各种限制与修饰系统的比较
Ⅱ Ⅰ Ⅲ
酶分子
内切酶与甲基化酶
分子不在一起
三亚基双功能酶
二亚基双功能酶
识别位点
4-6bp, 大多数为回文对称结构
二分非对称
5-7bp 非对称
切割位点 在识别位点中或靠近识别位点
无特异性,至少在识别位点外 1000bp
在识别位点下游 24-26bp
限制反应与甲基化反应
分开的反应
互斥
同时竞争
限制作用是否需用 ATP
No
Yes
Yes
二、限制酶识别的序列
1．限制酶识别序列的长度
限制酶识别序列的长度一般为 4-8 个碱基,最常见的为 6 个碱基（表2-3）当识别序列为 4 个和 6 个碱基时,它们可识别的序列在完全随机的情况下,平均每 256 个和 4096 个碱基中会出现一个识别位点（4^4=256,4^6=4096）以下是几个有代表性的种类,箭头指切割位置
4 个碱基识别位点：Sau3AⅠ ↓GATC
5 个碱基识别位点：EcoRⅡ ↓CCWGG
NciⅠ CC↓SGG
6 个碱基识别位点：EcoRⅠ G↓AATTC
HindⅢ A↓AGCTT
7 个碱基识别位点：BbvCⅠ CC↓TCAGC
PpuMⅠ RG↓GWCCY
8 个碱基识别位点：NotⅠ GC↓GGCCGC
SfiⅠ GGCCNNNN↓NGGCC
以上序列中部分字母代表的碱基如下
R=A 或 G Y=C 或 T M=A 或 C
K=G 或 T S=C 或 G W=A 或 T
H=A 或 C 或 T B=C 或 G 或 T V=A 或 C 或 G
D=A 或 G 或 T N=A 或 C 或 G 或 T
2．限制酶识别序列的结构
限制酶识别的序列大多数为回文对称结构,切割位点在 DNA 两条链相对称的位置 EcoRⅠ 和 HindⅢ 的识别序列和切割位置如下
EcoRⅠ G↓AATTC HindⅢ A↓AGCTT
CTTAA↑G TTCGA↑A
有一些限制酶的识别序列不是对称的,如 AccBSⅠ[CCGCTC（-3/-3）] 和 BssSⅠ[CTCGTG（-5/-1）]识别序列后面括号内的数字表示在两条链上的切割位置
AccBSⅠ CCG↓CTC BssSⅠ C↓TCGTG
GGC↑GAG GAGCA↑C
有一些限制酶可识别多种序列,如 AccⅠ 识别的序列是 GT↓MKAC ,也就是说可识别 4 种序列,其中两种是对称的,另两种是非对称的 HindⅡ 识别的序列是 GTY↓RAC
有一些限制酶识别的序列呈间断对称,对称序列之间含有若干个任意碱基如 AlwNⅠ 和 DdeⅠ ,它们的识别序列如下
AlwNⅠ CAGNNNC↓TG DdeⅠ C↓TNAG
GT↑CNNNGAC GANT↑C
3．限制酶切割的位置
限制酶对 DNA 的切割位置大多数在内部,但也有在外部的在外部的,又有两端、两侧和单侧之别切点在两端的有 Sau3AⅠ（↓GATC）、NlaⅢ（CATG↓）和 EcoRⅡ（↓CCWGG） 等；在两侧的有 BcgⅠ[（10/12）CGA（N）6TGC（12/10）]和 TspRⅠ（CASTGNN↓）, BcgⅠ 酶的切割特性与其它酶不同,它们在识别位点的两端各切开一个断点,而不是只产生一个断点切点在识别位点外侧的还有 BbvⅠ[GCAGC（8/12）] 和 BspMⅠ[ACCTGC（4/8）] 等
BcgⅠ ↓10（N）CGA（N）6TGC（N）12↓ TspRⅠ NNCAC（G）TGNN↓
↑12（N）CGA（N）6ACG（N）10↑ ↑NNGTG（C）ACNN
三、限制酶产生的末端
1．限制酶产生匹配粘端（matched ends）
识别位点为回文对称结构的序列经限制酶切割后,产生的末端为匹配粘端,亦即粘性末端（cohesive end）,这样形成的两个末端是相同的,也是互补的若在对称轴 5' 侧切割底物, DNA 双链交错断开产生 5' 突出粘性末端,如 EcoRⅠ ；若在 3'-侧切割,则产生 3' 突出粘性末端,如 KpnⅠ
NNG↓AATTCNN EcoRⅠ NNG AATTCNN
NNCTTAA↑GNN NNCTTAA GNN
2．限制酶产生平末端（Blunt end）
在回文对称轴上同时切割 DNA 的两条链,则产生平末端,如 HaeⅢ（GG↓CC）和 EcoRV（GAT↓ATC）产生平末端的 DNA 可任意连接,但连接效率较粘性末端低
3．限制酶产生非对称突出端
许多限制酶切割 DNA 产生非对称突出端当识别序列为非对称序列时,切割的 DNA 产物的末端是不同的,如 BbvCⅠ ,它的识别切割位点如下
CC↓TCAGC
GGAGT↑CG
有些限制酶识别简并序列,其识别的序列中有几种是非对称的如 AccⅠ ,它的识别切割位点如下,其中 GTAGAC 和 GTCTAC 为非对称
GT↓AT/CGAC
CATA/GC↑TG
有些限制酶识别间隔序列,间隔区域的序列是任意的,如 DraⅢ 和 EarⅠ
新年伊始，《 偶像 梦幻祭2》也迎来了公测以来第三期活动，「招募!飞舞蜜蜂」限定卡池及「心灵交错/汽车展览会」演唱会活动和各位制作人们正式见面了!这次活动采用巡演演唱会活动模式，与以往演唱会活动有所不同。为了让各位制作人能够尽情享受演唱会的乐趣，今天为大家带来这份活动指南。下面就一起看看吧!
「招募!飞舞蜜蜂」限定卡池开启
2021年1月1日12:00-1月15日11:59，全新限定卡池「招募!飞舞蜜蜂」正式开启!★5勤劳飞舞的蜜蜂樱河琥珀、★4不劳而飞的蜜蜂天城燐音、★3空腹飞舞的蜜蜂椎名丹希、★3观察飞舞的蜜蜂HiMERU，四张活动卡牌在活动卡池掉率提升!将活动卡编入队伍，也会获得「心灵交错/汽车展览会」演唱会活动的加成。
「心灵交错/汽车展览会」演唱会活动开启
因为汽车展览会的工作，「流星队N」与「ALKALOID」将要一同参与演出，但是铁虎却正在为不知该如何与后辈们接触而苦恼。一彩表示希望铁虎作为前辈能为自己展现出榜样。铁虎为自己的身份立场感到迷茫，与此同时，他找到忍以及翠开始商量后续的工作方针。
1月2日12:00-1月10日22:00「心灵交错/汽车展览会」演唱会活动正式开启!★5正义的汽车展览会南云铁虎、★5前进的汽车展览会天城一彩、★4奉献的汽车展览会仙石忍、★4幽微的汽车展览会礼濑真宵、★3守望的汽车展览会守泽千秋、★3心意与汽车展览会深海奏汰、★3主动的汽车展览会高峯翠、★3气势的汽车展览会白鸟蓝良、★3祈愿与汽车展览会风早巽。九张活动卡牌将在活动中与大家见面。
在活动中获得卡片后可在偶像之路解锁房间服装，南云铁虎及天城一彩SCR服装在卡片二次突破后可在偶像之路解锁。五星和四星卡可在偶像之路中解锁特殊演出。
「心灵交错/汽车展览会」活动指南
在限定活动期间，每日登录可领取活动支援奖励!1月2日首次登录可领取哨子(限时)x6;1月3日00:00-1月10日22:00期间内(共8天)，每日首次登录可领取哨子(限时)x3。
「心灵交错/汽车展览会」是《偶像梦幻祭2》第三次活动，也是第一次巡演演唱会活动。
首先，制作人们需要选择本期巡演演唱会活动奖励。四星卡片二选一(未通关20关之前可以随意更换)：★4奉献的汽车展览会仙石忍、★4幽微的汽车展览会礼濑真宵。五星卡片二选一(未通关30关之前可以随意更换)★5正义的汽车展览会南云铁虎、★5前进的汽车展览会天城一彩。
巡演演唱会活动模式中共有30个节点，每一个节点由四首歌曲以及3个任务组成。完成任务即可获得一颗星星。获得30颗和77颗星星，即可解锁20关(自选四星奖励关)以及30关(自选五星奖励关)。成功通关20关和30关，即可获得自选的四星和五星卡片!也就是说，在本期活动中，制作人们不管积分多少，只要完成30关必定可以拿到一张五星卡片。
请各位制作人们注意，在巡演演唱会活动中，每一关的四首歌曲消耗的BP值为3BP。
同时，本次巡演演唱会活动也是有活动积分奖励的，和之前的活动类似，完成演唱会和偶像工作收集活动pt，可获得活动限定卡片等奖励!累计3,00,000活动pt可以获得★5前进的汽车展览会天城一彩，累计3,500,000Pt可以获得★5正义的汽车展览会南云铁虎。因此在本次活动中，各位制作人们有机会获得双五星奖励!
活动pt和演唱会举行的分数有一定相关性，大家可以尽量让高阶、高等级、原唱、与歌曲属性相同的角色出场，这样就会获得更高的演唱会分数。同时「招募!飞舞蜜蜂」限定卡池中的卡片，在活动中会获得pt加成。
《偶像梦幻祭2》首期巡演演唱会活动「心灵交错/汽车展览会」已经和各位制作人们见面了，一起来看看会有怎样的惊喜等着你吧。
限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）:识别并切割特异的双链DNA序列的一种内切核酸酶。
[别名] Endodeoxyribonuclease
[酶反应] 限制性内切酶能分裂DNA分子在一限定数目的专一部位上。它能识别外源DNA并将其降解。
[单位定义] 在指明pH与37℃，在005mL反应混合物中，1小时消化1μg的λDNA的酶量为1单位。
[性状] 制品不含非专一的核酸水解酶(由10单位内切酶与1μg λDNA，保温16小时所得的凝胶电泳图谱的稳定性表示)。
限制性核酸内切酶的命名；一般是以微生物属名的第一个字母和种名的前两个字母组成，第四个字母表示菌株(品系)。例如，从Bacillus amylolique faciens H中提取的限制性内切酶称为Bam H，在同一品系细菌中得到的识别不同碱基顺序的几种不同特异性的酶，可以编成不同的号，如HindII、HindIII，HpaI、HpaII，MboI、MboI等。
在生物体内有一类酶，它们能将外来的DNA切断，即能够限制异源DNA的侵入并使之失去活力，但对自己的DNA却无损害作用，这样可以保护细胞原有的遗传信息。由于这种切割作用是在DNA分子内部进行的，故名限制性内切酶(简称限制酶)。限制酶是基因工程中所用的重要切割工具。科学家已从原核生物中分离出了许多种限制酶，并且已经商品化，在基因工程中广泛使用。根据限制酶切割的特点，可将它们分为两大类：一类是切割部位无特异性的；另一类是可特异性地识别核苷酸序列，即只能在一定的DNA序列上进行切割。这种能被特异性识别的切割部位都具有回文序列，也就是在切割部位，一条链正向读的碱基顺序与另一条链反向读的顺序完全一致。在基因工程中使用的多数是后一类酶。限制酶在特定切割部位进行切割时，按照切割的方式，又可以分为错位切和平切两种。错位切一般是在两条链的不同部位切割，中间相隔几个核苷酸，切下后的两端形成一种回文式的单链末端，这个末端能与具有互补碱基的目的基因的DNA片段连结，故称为黏性末端。这种酶在基因工程中应用最多。另一种是在两条链的特定序列的相同部位切割，形成一个无黏性末端的平口。
在基因操作过程中，除了限制酶以外，还要用一系列的酶类，才能完成全过程。例如，碱性磷酸酯酶、DNA多聚酶、末端转移酶、多核苷酸酶、逆转录酶等。这些酶都有各自特殊的催化功能，现在都有商品出售，可以根据不同的需要选用。
简短定义：
DNA限制性内切酶：
生物体内能识别并切割特异的双链DNA序列的一种内切核酸酶。它可以将外来的DNA切断的酶，即能够限制异源DNA的侵入并使之失去活力，但对自己的DNA却无损害作用，这样可以保护细胞原有的遗传信息。由于这种切割作用是在DNA分子内部进行的，故名限制性内切酶(简称限制酶)。
限 制 性 内 切 酶 综 述
(Restriction Endonucleases: An Overview)
30多年前，当人们在对噬菌体的宿主特异性的限制-修饰现象进行研究时，首次发现了限制性内切酶。细菌可以抵御新病毒的入侵，而这种"限制"病毒生存的办法则可归功于细胞内部可摧毁外源DNA的限制性内切酶。首批被发现的限制性内切酶包括来源于大肠杆菌的EcoR I和EcoR II，以及来源于Haemophilus influenzae的Hind II和Hind III。这些酶可在特定位点切开DNA，产生可体外连接的基因片段。研究者很快发现内切酶是研究基因组成、功能及表达非常有用的工具。
当限制性内切酶的应用在上世纪七十年代流传开来的时候，以NEB为代表的许多公司开始寻找更多的限制性内切酶。除了某些病毒以外，限制性内切酶只在原核生物中被发现。人们正在从数以千计的细菌及古细菌中寻找新的限制性内切酶。而对已测序的原核基因组数据分析表明，限制性内切酶在原核生物中普遍存在--所有自由生存的细菌和古细菌似乎都能编码限制性内切酶。
限制性内切酶的形式多样，从大小上来说，它们可以小到如Pvu II（157个氨基酸），也可以比1250个氨基酸的Cje I更大。在已纯化分类的3000种限制性内切酶中，已发现了超过250种的特异识别序列。其中有30%是在NEB发现的。对具有未知特异识别序列的限制性内切酶的研究发现工作仍在继续。人们从分析细胞提取物的生化角度研究的同时，也采用计算机分析已知的基因组数据，以期有更多的发现。尽管很多新发现的酶的识别序列与已有的重复--即同裂酶，仍然有识别新位点的酶不断被发现。
上世纪80年代，NEB开始克隆并表达限制性内切酶。克隆技术由于将限制性内切酶的表达与原有细胞环境分离开来，避免了原细胞中其它内切酶的污染，从而提高了酶的纯度。此外，克隆技术提高了限制性内切酶的产量，简化了纯化过程，使得生产成本显著降低；克隆的基因很容易进行测序分析，表达出的蛋白也能进行X射线结晶分析，这使得我们对于克隆产物更加确定。
限制性内切酶 一、限制与修饰（Restriction and modification）
1．限制与修饰现象
早在 50 年代初，有许多学者发现了限制与修饰现象，当时称作寄主控制的专一性（host controlled specificity）。 l 噬菌体表现的现象便具有代表性和普遍性，其在不同宿主中的转染频率可说明这一问题（表 2-1）。 l 在感染某一宿主后，再去感染其它宿主时会受到限制。
Ecoli 菌株 λ噬菌体感染率
lK lB lC
Ecoli K 1 10-4 10-4
Ecoli B 10-4 1 10-4
Ecoli C 1 1 1
说明 K 和 B 菌株中存在一种限制系统，可排除外来的 DNA 。 10-4 的存活率是由宿主修饰系统作用的结果，此时限制系统还未起作用。而在 C 菌株不能限制来自 K 和 B 菌株的 DNA 。限制作用实际就是限制酶降解外源 DNA ，维护宿主遗传稳定的保护机制。甲基化是常见的修饰作用，可使腺嘌呤 A 成为 N6 甲基-腺膘呤，胞嘧啶 C 成为 5' 甲基胞嘧啶。通过甲基化作用达到识别自身遗传物质和外来遗传物质的目的。
2．限制酶的发现
在 20 世纪 60 年代，人们就注意到 DNA 在感染宿主后会被降解的现象，从而提出限制性切酶和限制酶的概念。 1968 年，首次从 Ecoli K 中分离到限制酶，它有特定的识别位点但没有特定的切割位点，其中切割位点离识别位点达 1000bp 以上。
1970 年，美国约翰·霍布金斯大学的 H Smith 于偶然中发现，流感嗜血杆菌 （Haemophilus influenzae）能迅速降解外源的噬菌体 DNA ，其细胞提取液可降解 Ecoli DNA ，但不能降解自身 DNA ，从而找到 HindⅡ 限制性内切酶。 HindⅡ 限制性内切酶位点和切割位点如下：
5 '… GTPy ↓ PuAC … 3 '
3 '… CAPu ↑ PyTG … 5 '
从此以后，发现的限制酶越来越多，并且许多已经在实践中得到应用。 EcoRⅠ 是应用最广泛的限制性内切酶，酶切位点和切割位点如下：
5' G↓AATTC 3'
3' CTTAA↑G 5'
限制性内切酶的命名遵循一定的原则，主要依据来源来定，涉及宿主的种名、菌株号或生物型。命名时，依次取宿主属名第一字母，种名头两个字母，菌株号，然后再加上序号（罗马字）。如 HindⅢ 限制性内切酶， Hin 指来源于流感嗜血杆菌， d 表示来自菌株 Rd ， Ⅲ 表示序号。以前在限制性内切酶和修饰酶前加 R 或 M ，且菌株号和序号小写。但现在限制性内切酶名称中的 R 省略不写。
1986 年下半年发现 615 种限制酶和 98 种甲基化酶； 1998 年发现 10000 种细菌或古细菌中存在 3000 种酶，且酶有 200 多种特异性。到 2005 年 1 月，共发现 4342 种限制酶和甲基化酶，其中限制酶有 3681 种，包括 Ⅰ 型、 Ⅱ 型、 Ⅲ 型限制酶各有 59 、3612 、10 种，甲基化指导的限制酶有 3 种，商业化的限制酶有 588 种，在 Ⅱ 型限制酶中共有 221 种特异性。
3．限制与修饰系统的种类
根据酶的亚单位组成、识别序列的种类和是否需要辅助因子，限制与修饰系统至少可分为四类。表 2-2 是各种限制与修饰系统的比较。
Ⅱ 型（type Ⅱ）限制与修饰系统所占的比例最大，达 93% 。 Ⅱ 型酶相对来说最简单，它们识别回文对称序列，在回文序列内部或附近切割 DNA ，产生带 3'- 羟基和 5'- 磷酸基团的 DNA 产物，需 Mg2+ 的存在才能发挥活性，相应的修饰酶只需 SAM 。识别序列主要为 4-6bp ，或更长且呈二重对称的特殊序列，但有少数酶识别更长的序列或简并序列，切割位置因酶而异，有些是隔开的。
Ⅱs 型（type Ⅱs）限制与修饰系统，占 5% ，与 Ⅱ 型具有相似的辅因子要求，但识别位点是非对称，也是非间断的，长度为 4-7bp ，切割位点可能在识别位点一侧的 20bp 范围内。
Ⅱ 型限制酶一般是同源二聚体（homodimer），由两个彼此按相反方向结合在一起的相同亚单位组成，每个亚单位作用在 DNA 链的两个互补位点上。修饰酶是单体，修饰作用一般由两个甲基转移酶来完成，分别作用于其中一条链，但甲基化的碱基在两条链上是不同的。
在 Ⅱ 型限制酶中还有一类特殊的类型，该酶只切割双链 DNA 中的一条链，造成一个切口，这类限制酶也称切口酶 （nicking enzyme），如 NBst NBI 。
Ⅰ 型（type Ⅰ）限制与修饰系统的种类很少，只占 1% ，如 EcoK 和 EcoB 。其限制酶和甲基化酶 （即 R 亚基和 M 亚基） 各作为一个亚基存在于酶分子中，另外还有负责识别 DNA 序列的 S 亚基，分别由 hsdR 、hsdM 和 hsdS 基因编码，属于同一操纵子（转录单位）。 EcoK 编码基因的结构为 R2M2S 。 EcoB 编码基因的结构为 R2M4S2 。
EcoB 酶的识别位点如下，其中两条链中的 A 为甲基化位点， N 表示任意碱基。
TGA（N）8TGCT
EcoK 酶的识别位点如下，其中两条链中的 A 为可能的甲基化位点。
AA°C（N）6GTGC
但是 EcoB 酶和 EcoK 酶的切割位点在识别位点 1000bp 以外，且无特异性。
Ⅲ 型（type Ⅲ）限制与修饰系统的种类更少，所占比例不到 1% ，如 EcoP1 和 EcoP15 。它们的识别位点分别是 AGACC 和 CAGCAG ，切割位点则在下游 24-26bp 处。
在基因操作中，一般所说的限制酶或修饰酶，除非特指，均指 Ⅱ 型系统中的种类。
表2-2：各种限制与修饰系统的比较
Ⅱ Ⅰ Ⅲ
酶分子
内切酶与甲基化酶
分子不在一起
三亚基双功能酶
二亚基双功能酶
识别位点
4-6bp, 大多数为回文对称结构
二分非对称
5-7bp 非对称
切割位点 在识别位点中或靠近识别位点
无特异性，至少在识别位点外 1000bp
在识别位点下游 24-26bp
限制反应与甲基化反应
分开的反应
互斥
同时竞争
限制作用是否需用 ATP
No
Yes
Yes
二、限制酶识别的序列
1．限制酶识别序列的长度
限制酶识别序列的长度一般为 4-8 个碱基，最常见的为 6 个碱基（表2-3）。当识别序列为 4 个和 6 个碱基时，它们可识别的序列在完全随机的情况下，平均每 256 个和 4096 个碱基中会出现一个识别位点（4^4=256，4^6=4096）。以下是几个有代表性的种类，箭头指切割位置。
4 个碱基识别位点：Sau3AⅠ ↓GATC
5 个碱基识别位点：EcoRⅡ ↓CCWGG
NciⅠ CC↓SGG
6 个碱基识别位点：EcoRⅠ G↓AATTC
HindⅢ A↓AGCTT
7 个碱基识别位点：BbvCⅠ CC↓TCAGC
PpuMⅠ RG↓GWCCY
8 个碱基识别位点：NotⅠ GC↓GGCCGC
SfiⅠ GGCCNNNN↓NGGCC
以上序列中部分字母代表的碱基如下。
R=A 或 G Y=C 或 T M=A 或 C
K=G 或 T S=C 或 G W=A 或 T
H=A 或 C 或 T B=C 或 G 或 T V=A 或 C 或 G
D=A 或 G 或 T N=A 或 C 或 G 或 T
2．限制酶识别序列的结构
限制酶识别的序列大多数为回文对称结构，切割位点在 DNA 两条链相对称的位置。 EcoRⅠ 和 HindⅢ 的识别序列和切割位置如下。
EcoRⅠ G↓AATTC HindⅢ A↓AGCTT
CTTAA↑G TTCGA↑A
有一些限制酶的识别序列不是对称的，如 AccBSⅠ[CCGCTC（-3/-3）] 和 BssSⅠ[CTCGTG（-5/-1）]。识别序列后面括号内的数字表示在两条链上的切割位置。
AccBSⅠ CCG↓CTC BssSⅠ C↓TCGTG
GGC↑GAG GAGCA↑C
有一些限制酶可识别多种序列，如 AccⅠ 识别的序列是 GT↓MKAC ，也就是说可识别 4 种序列，其中两种是对称的，另两种是非对称的。 HindⅡ 识别的序列是 GTY↓RAC 。
有一些限制酶识别的序列呈间断对称，对称序列之间含有若干个任意碱基。如 AlwNⅠ 和 DdeⅠ ，它们的识别序列如下。
AlwNⅠ CAGNNNC↓TG DdeⅠ C↓TNAG
GT↑CNNNGAC GANT↑C
3．限制酶切割的位置
限制酶对 DNA 的切割位置大多数在内部，但也有在外部的。在外部的，又有两端、两侧和单侧之别。切点在两端的有 Sau3AⅠ（↓GATC）、NlaⅢ（CATG↓）和 EcoRⅡ（↓CCWGG） 等；在两侧的有 BcgⅠ[（10/12）CGA（N）6TGC（12/10）]和 TspRⅠ（CASTGNN↓）， BcgⅠ 酶的切割特性与其它酶不同，它们在识别位点的两端各切开一个断点，而不是只产生一个断点。切点在识别位点外侧的还有 BbvⅠ[GCAGC（8/12）] 和 BspMⅠ[ACCTGC（4/8）] 等。
BcgⅠ ↓10（N）CGA（N）6TGC（N）12↓ TspRⅠ NNCAC（G）TGNN↓
↑12（N）CGA（N）6ACG（N）10↑ ↑NNGTG（C）ACNN
三、限制酶产生的末端
1．限制酶产生匹配粘端（matched ends）
识别位点为回文对称结构的序列经限制酶切割后，产生的末端为匹配粘端，亦即粘性末端（cohesive end），这样形成的两个末端是相同的，也是互补的。若在对称轴 5' 侧切割底物， DNA 双链交错断开产生 5' 突出粘性末端，如 EcoRⅠ ；若在 3'-侧切割，则产生 3' 突出粘性末端，如 KpnⅠ 。
NNG↓AATTCNN EcoRⅠ NNG AATTCNN
NNCTTAA↑GNN NNCTTAA GNN
2．限制酶产生平末端（Blunt end）
在回文对称轴上同时切割 DNA 的两条链，则产生平末端，如 HaeⅢ（GG↓CC）和 EcoRV（GAT↓ATC）。产生平末端的 DNA 可任意连接，但连接效率较粘性末端低。
3．限制酶产生非对称突出端
许多限制酶切割 DNA 产生非对称突出端。当识别序列为非对称序列时，切割的 DNA 产物的末端是不同的，如 BbvCⅠ ，它的识别切割位点如下。
CC↓TCAGC
GGAGT↑CG
有些限制酶识别简并序列，其识别的序列中有几种是非对称的。如 AccⅠ ，它的识别切割位点如下，其中 GTAGAC 和 GTCTAC 为非对称。
GT↓AT/CGAC
CATA/GC↑TG
有些限制酶识别间隔序列，间隔区域的序列是任意的，如 DraⅢ 和 EarⅠ
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