动物学实验的实验动物常见的处理方法

一、编号

实验动物常需要标记以示区别。编号的方法很多，根据动物的种类数量和观察时间长短等因素来选择合适的标记方法。

(一)挂牌法：将号码烙压在圆形或方形金属牌上(最好用铝或不锈钢的,它可长期使用不生锈),或将号码按实验分组编号烙在栓动物颈部的皮带上，将此颈圈固定在动物颈部。该法适用于狗等大型动物。

(二)打号法：用刺数钳(又称耳号钳)将号码打在动物耳朵上。打号前用蘸有酒精的棉球擦净耳朵，用耳号钳刺上号码，然后在烙印部位用棉球蘸上溶在食醋里的黑墨水擦抹。该法适用于耳朵比较大的兔、狗等动物。

(三)针刺法：用七号或八号针头蘸取少量碳素墨水，在耳部、前后肢以及尾部等处刺入皮下，在受刺部位留有一黑色标记。该法适用于大小鼠、豚鼠等。在实验动物数量少的情况下，也可用于兔、狗等动物。

(四)化学药品涂染动物被毛法：经常应用的涂染化学药品有

涂染红色：05%中性红或品红溶液

涂染**：3-5%苦味酸溶液

涂染黑色：煤焦油的酒精溶液

根据实验分组编号的需要，可用一种化学药品涂染实验动物动物背部被毛就可以。如果实验动物数量较多，则可以选择两种染料。该方法对于实验周期短的实验动物较合适，时间长了染料易退掉；对于哺乳期的子畜也不适合，因母畜容易咬死子畜或把染料舔掉。

(五)剪毛法：该法适用于大、中型动物，如狗、兔等。方法是用剪毛刀在动物一侧或背部剪出号码，此法编号清楚可靠，但只适于短期观察。

(六)打孔或剪缺口法：可用打孔机在兔耳一定位置打一小孔来表示一定的号码。如用剪子剪缺口,应在剪后用滑石粉捻一下,以免愈合后看不出来。该法可以编至1～ 9999号，此种方法常在饲养大量动物时作为终身号采用。

二、分组

(一)分组的原则：进行动物实验时，经常需要将选择好的实验动物按研究的需要分成若干组。动物分组应按随机分配的原则，使每只动物都有同等机会被分配到各个实验组与对照组中去，以避免各组之间的差别,影响实验结果，特别是进行准确的统计检验,必须在随机分组的基础上进行。

每组动物数量应按实验周期长短、实验类型及统计学要求而定。如果是慢性实验或需要定期处死动物进行检验的实验，就要求选较多的动物，以补足动物自然死亡和认为处死所丧失的数量，确保实验结束时有合乎统计学要求的动物数量存在。

(二)建立对照组：分组时应建立对照组。1自身对照组：是指实验数据而言。实验动物本身在实验处理前、后两个阶段的各项相关数据就分别是对照组和实验组的实验结果，此法可排除生物间的个体差异。2平行对照组：有正对照组和负对照组两种。给实验组动物某种处理，而给正对照组用同样方法进行处理，但并不采用实验所要求的药物或手段，负对照组则不给任何处理。3具体分组时，应避免人为因素, 随机把所有的动物进行编号，然后令其双数为A组(实验组),单数为B组(对照组)即可或反之。如果要分若干个组时，应该用随机数字表示进行完全随机分组。 一、实验动物的除毛

在动物实验中，被毛有时会影响实验操作与观察，因此必须除去。除去被毛的方法有剪毛、拔毛、剃毛和脱毛等。

(一)剪毛法：剪毛法是将动物固定后，先用蘸有水的纱布把被毛浸湿，再用剪毛剪刀紧贴皮肤剪去被毛。不可用手提起被毛，以免剪破皮肤。剪下的毛应集中放在一容器内，防止到处飞扬。给狗、羊等动物采血或新生乳牛放血制备血清常用此法。

(二)拔毛法：拔毛法是用拇指和食指拔去被毛的方法。在兔耳缘静脉注射或尾静脉注射时常用此法。

(三)剃毛法：剃毛法是用剃毛刀剃去动物被毛的方法。如动物被毛较长，先要用剪刀将其剪短，再用刷子蘸温肥皂水将剃毛部位浸透，然后再用剃毛刀除毛。本法适用于暴露外科手术区。

(四)脱毛法：脱毛法是用化学药品脱去动物被毛的方法。首先将被毛剪短，然后用棉球蘸取脱毛剂，在所需部位涂一薄层，2～3分钟后用温水洗去脱落的被毛，用纱布擦干，再涂一层油脂即可。

适用于狗等大动物的脱毛剂配方为：硫化钠10g，生石灰15g，溶于100ml水中。

适用于兔、鼠等动物的脱毛剂的配方为：1 硫化钠3g,肥皂粉1g,淀粉7g,加适量水调成糊状；2 硫化钠8g,淀粉7g，糖4g，甘油5g，硼砂1g,加水75ml；3 硫化钠8g溶于100ml水中。

二、实验动物的给药

在动物实验中，为了观察药物对机体功能、代谢及形态引起的变化，常需要将药物注入动物体内。给药的途径和方法多种多样，可根据实验目的、实验动物种类和药物剂型、剂量等情况确定。

(一)注射给药法

1 皮下注射　注射时用左手拇指及食指轻轻捏起皮肤，右手持注射器将针头刺入,固定后即可进行注射。一般小鼠在背部或前肢腋下，大鼠在背部或侧下腹部；豚鼠在后大腿内侧、背部等脂肪少的部位；兔在背部或耳根部注射；蛙可在脊背部淋巴囊注射；狗多在大腿外侧注射，拔针时，轻按针孔片刻，防药液逸出。

2 皮内注射　此法用于观察皮肤血管的通透性变化或观察皮内反应。 如将一定量的放射性同位素溶液、颜料或致炎物质、药物等注入皮内，观察其消失速度和局部血液循环变化，作为皮肤血管通透性观察指标之一。方法是：将动物注射部位的毛剪去，消毒后，用皮试针头紧贴皮肤皮层刺入皮内，然后使针头向上挑起并再稍刺入，即可注射药液。注射后可见皮肤表面鼓起一白色小皮丘。

3 肌肉注射　当给动物注射不溶于水而混悬于油或其他溶剂中的药物时,常采用肌肉注射。肌肉注射一般选用肌肉发达、无大血管经过的部位，多选臀部。注射时针头要垂直快速刺入肌肉，如无回血现象即可注射。给大、小鼠作肌肉注射时，选大腿外侧肌肉进行注射。

4 腹腔注射　先将动物固定,腹部用酒精棉球擦试消毒，然后在左或右侧腹部将针头刺入皮下，沿皮下向前推进约05厘米，再使针头与皮肤呈45 度角方向穿过腹肌刺入腹腔，此时有落空感，回抽无肠液、尿液后，缓缓推入药液。此法大小鼠用的较多。

5 静脉注射　是将药液直接注射于静脉管内，使其随着血液分布全身,迅速奏效。但排泄较快，作用时间较短。

6 淋巴囊注射　蛙类常采用此法,其皮下有数个淋巴囊，注入药物甚易吸收。腹部淋巴囊和头部淋巴囊常作为蛙类给药途径。一般多选用腹部淋巴囊给药。注射时将针头从蛙大腿上端刺入，经大腿肌层入腹壁肌层，再进入腹壁皮下，即进入淋巴囊，然后注入药液。

(二)经口给药法

1 口服法：把药物放入饲料或溶于饮水中让动物自动摄取。此法优点在于简单方便，缺点是不能保证剂量准确。一般适用于对动物疾病的防治或某些药物的毒性实验，制造某些与食物有关的人类疾病动物模型。

2 灌胃法：在急性实验中,多采用灌胃法。此法剂量准确。灌胃法是用灌胃器将所应投给动物的药灌到动物胃内。灌胃器由注射器和特殊的灌胃针构成。小鼠的灌胃针长约4～5cm，直径为1mm，大鼠的灌胃针长约6～8cm，直径约12mm。灌胃针的尖端焊有一小圆金属球，金属球为中空的。焊金属球的目的是防止针头刺入气管或损伤消化道。针头金属球端弯曲成20°左右的角度，以适应口腔、食道的生理弯曲度走向。

(三)其它途径给药方法

1 呼吸道给药：呈粉尘、气体及蒸气或雾等状态的药物或毒气,均需要通过动物呼吸道给药。如实验时给动物乙醚作吸入麻醉、用锯末烟雾制作慢性气管炎动物模型等，特别在毒理学实验中应用更为广泛。

2 皮肤给药：为了鉴定药物或毒物经皮肤的吸收作用、局部作用、 致敏作用和光感作用等，均需采用经皮肤给药方法。如兔和豚鼠常采用背部一定面积的皮肤脱毛后，将一定的药液涂在皮肤上，药液经皮肤吸收。

3 脊髓腔内给药：此法主要用于锥管麻醉或抽取脑脊液。

4 脑内给药：此法常用于微生物学动物实验,将病原体等接种于被检动物脑内，然后观察接种后的各种变化。

5 直肠内给药：此种方法常用于动物麻醉。兔直肠内给药时,常采用灌肠的胶皮管或用14号导尿管代替。

6 关节腔内给药：此法常用于关节炎的动物模型复制。

一、实验目的： 通过实际操作，掌握小鼠的一般操作方法，包括小鼠的抓拿、标记、给药（灌胃、腹腔注射、皮下、肌肉、尾静脉注射）、取血（眶后静脉丛，摘眼球）、脊椎脱臼法处死、大体解剖。

二、实验动物： 昆明小鼠2只（1雌1雄）

三、实验步骤

1、抓取和固定，标记

2、去毛

3、给药：消化道、腹腔往射、尾静脉注射

4、取血：眼眶后静脉丛、尾静脉、眼球摘除法、断头法

5、麻醉：氯胺酮腹腔麻醉

6、处死：脊椎脱臼法

7、解剖：

雄性：睾丸、附睾、输精管、鼠蹊腺（在膀胱下方，胶质状，透明）

雌性：双角子宫、卵巢

肾上腺、胆囊、甲状腺、胃、肝脏、脾、肺、肾、心脏、甲状腺

四、实验结果

1、抓取和固定标记：

抓取：抓小鼠的尾根部

固定：抓住小鼠的尾根部，让小鼠在粗糙平面上爬行，后拉尾跟部，右手的拇指和食指抓住小鼠两耳及其间的颈部皮肤，小指和无名指将尾巴固定在手掌面。

2、灌胃法：左手抓取小鼠固定后，右手持特制灌胃针，沿一侧口角进针，紧贴咽后壁，头后仰以便伸直消化道，进针2/3后灌生理盐水05ml

3、注射给药：

腹腔注射：

从下腹部的两侧进针，进针时针与腹部成45°。进针后稍微晃动针，如无粘滞感则可注射药物。

尾静脉注射：一人固定小鼠，另一人用左手中指和拇指将尾拉直，食指托住尾部在尾动脉位置进针注射05ml生理盐水。注射完毕拔出针头，用无菌棉球压迫止血。

4、采血

从眼角内侧05cm处进针

眼球摘除法：左手抓取用固定小鼠，右手持弯头镊在眼球根部将眼球摘除，头朝下，眼眶内血迅速流出。

5、麻醉：

05%氯胺酮腹腔麻醉：本小鼠重22g，按100mg/kg的药量给药，2分钟麻醉成功

6、处死：

脊椎脱臼法：按住头部，将尾根部向后上方以短促的力量拉即可致死

7、解剖：

雄性：寻找到睾丸、附睾、输精管、鼠蹊腺

雌性：双角子宫、卵巢372肾上腺：米粒大小

胰腺：位于胃下方，类似于脂肪组织，浑浊状374， 胆囊：芝麻大小，浅绿色，半透明，甲状腺：紧贴环状软骨，另可解剖出胃、肝脏、脾、肺、肾、心脏。

五、实验讨论

1、小鼠抓取的感受：

小鼠性情较温顺，一般不会咬人，比较容易抓取固定。通常用右手提起小鼠尾巴将其放在鼠笼盖或其它粗糙表面上，在小鼠向前挣扎爬行时，用左手拇指和食指捏住其双耳及颈部皮肤，将小鼠置于左手掌心、无名指和小指夹其背部皮肤和尾部，即可将小鼠完全固定。如要进行手术或心脏采血应先行麻醉再操作，如进行解剖实验则必须先行无痛处死后再进行。

2、小鼠尾静脉注射感受：

首先，注射前尾巴用稍热的水浸泡几分钟，有利于注射；其次，先远后尽，不要一开始就从尾根部，那样失败了不好办；再次，进血管后注意保持稳定，针尖很容易刺穿血管的。尾静脉就在尾巴的正左右两边，先用酒精用力擦，可以去掉部分角质，然后按住近心端让充血，就很容易看到了。进针大概1~2厘米是最合适的。

尾静脉注射时，可用45~50度的温水浸润半分钟或用酒精擦拭，可使血管扩张，同时也可软化表皮角质。以左手拇指和食指夹住鼠尾，使静脉充盈，中指帮助无名指和小指捏住鼠尾末梢，右手持注射器（连5号细针头），针头与静脉夹角一般小于30度，从距尾尖2 - 3厘米处进针，此处皮薄易进入，先抽回血，见到血后再缓慢注入少量药液，如无阻力，表示针头已进入静脉，可继续往入。一般推注速度为005 - 010m秒，一次注入量为005 - 025ml/10g体重。如反复注入，应尽可能从尾末端开始，以后向尾根部方向移动注射。

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肌肉骨骼系统的疾病是引起慢性疼痛和功能障碍的主要原因。 虽然该系统的各种成分再生能力很强，但它们仍然可能劳损、损伤或发炎。随着年龄的增长，身体各机能的再生能力也随之减弱，这就让老年人成为肌肉骨骼障碍疾病的高发人群之一。

肌肉骨骼障碍包括哪些疾病

肌肉骨骼障碍是该类疾病的总称，其包括 骨关节炎、骨质疏松症、肌肉减少症、椎间盘退行性病变等 。其中骨关节炎是一种最常见的致残性肌肉骨骼疾病。骨关节炎（OA）是一种在活动关节中产生的疾病，它是老年人慢性疼痛和残疾的元凶之一。许多研究已经报道了衰老细胞会在老年软骨中积累并且参与骨关节炎的发生。通过在小鼠膝盖注射衰老细胞会产生类似于骨关节炎的症状，这证明了细胞衰老是骨关节炎产生原因之一。

骨质疏松症则表现为总骨量减少和骨折的风险增加。 衰老过程中骨质流失的原因是骨形成的减少和骨髓脂肪生成的增加。 衰老还与骨骼肌质量和功能的显著降低相关联，这种骨骼肌机能的降低被定义为肌肉减少症，这会导致老年人衰弱并增加死亡率。椎间盘退行性病变（IVDD）被认为是衰老过程中的自然进程，通常与慢性背部疼痛有关。

衰老，导致肌肉骨骼障碍的元凶

免疫力的破坏是一个过程，如果人们在生活中不太注意一些习惯，这些习惯久而久之就成为了我们免疫力的杀手。

除了日常损耗带来的威胁，多项研究表明， 衰老是导致肌肉骨骼障碍的元凶之一，但也是研究如何治疗肌肉骨骼障碍的突破口之一 。例如针对具有致残性的骨关节炎，通过p16-3MR转基因小鼠（由p16INK4A的启动子启动转录合成Renilla荧光素酶（发光检测）、单体RFP和Ⅰ型单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV-TK）的缺失突变功能结构域）。利用该小鼠可通过体内发光和mRFP荧光鉴定来分离p16INK4A阳性的细胞。

其次，HSV-TK可通过更昔洛韦（GCV）治疗特异性清除p16INK4a阳性细胞）或药理方法，从而在创伤后骨关节炎小鼠模型中实现对衰老细胞的选择性清除，这会阻止OA的进一步发展，同时也会增加细胞外基质（ECM）成分的合成，降低基质金属蛋白酶MMP-13和白介素IL-1β的表达，最终减轻病痛。

此外，消除自然衰老中积累的p16INK4a细胞可以减轻软骨退化。在骨关节炎患者的软骨细胞中，使用UBX0101处理可以增加ECM蛋白的合成，并有利于再生环境的形成；另一种可以促进衰老细胞裂解的药物非诺贝特（fenofibrate，一种PPARα激动剂）可以减轻IL-1β处理后人软骨移植物中的蛋白聚糖的损失。通过抑制抗凋亡蛋白c-IAP ½（细胞凋亡抑制蛋白，cell inhibitor of apoptosis protein）来局部消除衰老细胞，这可以在创伤后骨关节炎大鼠模型中减少SASP的分泌并促进再生。

最后，越来越多的证据表明，靶向与SASP相关信号网络中的分子（例如雷帕霉素和二甲双胍）有利于软骨再生环境的形成，并在临床前期的研究中发挥有益作用。

衰老细胞清除疗法及其分子靶点

对于 骨质疏松 而言，研究表明通过穿刺检查老年人类和小鼠发现他们的成骨祖细胞、成骨细胞和骨细胞中有均有较高水平的p16INK4a表达。Ercc1-/Δ是一种由于DNA修复功能受到损坏的早衰小鼠模型，其DNA的损伤会逐渐积累。通过对这种小鼠进行衰老细胞清除的鸡尾酒疗法，即使用达沙替尼（Dasatinib，具有多种功能的抗癌药物；上表）加上槲皮素（Quercetin，具有多种功能的多酚）进行治疗后，发现其骨中矿物质含量和密度均有增加。

另外，通过基因工程方法（INK-ATTAC小鼠：p16INK4a+细胞含有p16INK4a启动子报告基因，并含有FK506结合蛋白（FKBP）和caspase 8（Casp8）组成的融合蛋白表达系统。在该小鼠模型中，合成分子AP20187可诱导FKBP-Casp8二聚化，进而可通过caspase依赖的细胞凋亡反应选择性杀死p16INK4A阳性的细胞，另外药理方法（Dasatinib+Quercetin）处理可以增强抗吸收途径和合成代谢途径，从而增加老年小鼠的骨量和骨强度并降低由于放射治疗引起的骨损失。多项临床前期研究表明，对氧化应激起抑制作用的分子可延缓骨细胞的衰老并减少SASP的分泌，并改善骨骼结构。

一项研究证实了细胞衰老在促进肌肉衰弱中的作用，这有益于肌肉减少症的治疗。 衰老细胞清除疗法D+Q处理的老年小鼠身体机能（行走速度、耐力和抓力）得到了显著改善。

最近的研究也表明肌卫星细胞衰老是肌肉减少症发病的关键。肌卫星细胞是驻留的肌肉干细胞，它是损伤或运动后骨骼肌再生和发育所必需的，在这个过程中卫星细胞会打破静止状态，进行增殖并促进肌肉纤维的修复和生长。在衰老的骨骼肌（28-32月龄）和早衰小鼠中，卫星细胞转换的激活受到衰老转换的影响，这可以通过SA-β半乳糖苷酶染色加深以及p16INK4a和Igfbp5的表达量的增加来证明。研究发现老年人卫星细胞的衰老是由线粒体自噬降低和ROS增加引起的，通过抑制p16INK4a和ROS或激活自噬作用可以恢复卫星细胞的功能和肌肉再生。此外，通过促进Smad3介导的CDKs表达上调（如p15INK4B和p21WAF1 / Cip1）。转化生长因子TGF-β信号通路也参与了卫星细胞的衰老，抑制TGF-β信号传导可促进衰老小鼠的肌肉再生。衰老的纤维/脂肪形成祖细胞和有丝分裂后的肌纤维也在衰老小鼠运动后的骨骼肌中发现，这些衰老细胞亚型在肌肉衰减症中的作用有待进一步研究。

此外，机体其他细胞类型的衰老也可能导致肌肉减少症，将衰老的前体脂肪细胞移植到健康小鼠中会明显导致其身体机能障碍和肌肉衰弱，这有力地证明了这个观点。

最后，在退行性肌肉萎缩性疾病，如肌肉营养不良的小鼠模型中也有相关卫星细胞衰老的报道，这表明细胞衰老在其他肌肉萎缩状况的病理中也起作用。

关于 椎间盘退行性病变 的治疗研究表明，用D+Q清除早衰小鼠的衰老细胞会增加椎间盘髓核（NP）中蛋白聚糖的水平，这表明组织中的细胞外基质情况有所改善。用姜黄素或邻香兰素（o-vanillin）清除衰老的人类髓核细胞会增加Ki-67阳性细胞的数量并降低SASP的分泌，并促进胞外基质成分的合成。与年轻小鼠相比，特异性清除衰老的p16-3MR小鼠中的p16INK4a阳性细胞可以改善了聚集性蛋白聚糖的破碎和椎间盘的组织学状态，即促进聚集性蛋白聚糖的表达和抑制MMP-13的表达。

细胞老化 衰老之源

人体是由成千上万个细胞组成，衰老的本质就是细胞的老化。正如肌肉骨骼障碍疾病同衰老细胞密不可分一样，还有很多疾病都是因为细胞衰老导致的。 其实人体内的细胞每天都在经历新生到死亡的过程，只是当新生细胞赶不上死亡细胞的速度时，衰老就开始悄然而至。 例如我们熟知的免疫细胞，不仅有抵御外来病毒细菌的作用，还有清除衰老死亡细胞的功能，一旦它们的数量和质量下降，工作效率自然降低，抵御外来入侵细菌的能力便会减弱，清除衰老死亡细胞的速度也会降低，导致我们新陈代谢迟缓，不能够及时补给日常生活中的损耗。

细胞存储技术的发明与进步一定程度上解决了衰老对于我们身体健康的威胁。虽然细胞也会衰老退化，但是年轻健康的细胞却能在生物技术的辅助下被冻存起来，保持其良好的状态。当我们身体“库存”告急时，这些存储的细胞可以通过先进的手段激活复制，为身体及时补充弹药。这也是细胞存储又被称作“生命银行”的原因所在。