盐的脱盐

脱盐粗范地说就是将“盐”脱除的方法或过程，这个“盐”是更宽泛的“化学盐”不只常用的食用“盐”。脱盐简单地说就是去除水中的阴阳离子。脱盐的方法有电渗析和反渗透法及新近重新热火起来的正向渗透等。

二、蛋白质的分离纯化

蛋白质的分离纯化方法很多，主要有：

（一）根据蛋白质溶解度不同的分离方法

1、蛋白质的盐析

中性盐对蛋白质的溶解度有显著影响，一般在低盐浓度下随着盐浓度升高，蛋白质的溶解度增加，此称盐溶；当盐浓度继续升高时，蛋白质的溶解度不同程度下降并先后析出，这种现象称盐析，将大量盐加到蛋白质溶液中，高浓度的盐离子（如硫酸铵的SO4和NH4)有很强的水化力，可夺取蛋白质分子的水化层，使之“失水”，于是蛋白质胶粒凝结并沉淀析出。盐析时若溶液pH在蛋白质等电点则效果更好。由于各种蛋白质分子颗粒大小、亲水程度不同，故盐析所需的盐浓度也不一样，因此调节混合蛋白质溶液中的中性盐浓度可使各种蛋白质分段沉淀。

影响盐析的因素有：（1）温度：除对温度敏感的蛋白质在低温（4度）操作外，一般可在室温中进行。一般温度低蛋白质溶介度降低。但有的蛋白质（如血红蛋白、肌红蛋白、清蛋白）在较高的温度（25度）比0度时溶解度低，更容易盐析。（2）pH值：大多数蛋白质在等电点时在浓盐溶液中的溶介度最低。（3）蛋白质浓度：蛋白质浓度高时，欲分离的蛋白质常常夹杂着其他蛋白质地一起沉淀出来（共沉现象）。因此在盐析前血清要加等量生理盐水稀释，使蛋白质含量在25-30%。

蛋白质盐析常用的中性盐，主要有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等。

其中应用最多的硫酸铵，它的优点是温度系数小而溶解度大（25度时饱和溶液为41M，即767克/升；0度时饱和溶解度为39M，即676克/升），在这一溶解度范围内，许多蛋白质和酶都可以盐析出来；另外硫酸铵分段盐析效果也比其他盐好，不易引起蛋白质变性。硫酸铵溶液的pH常在45-55之间，当用其他pH值进行盐析时，需用硫酸或氨水调节。

蛋白质在用盐析沉淀分离后，需要将蛋白质中的盐除去，常用的办法是透析，即把蛋白质溶液装入秀析袋内（常用的是玻璃纸），用缓冲液进行透析，并不断的更换缓冲液，因透析所需时间较长，所以最好在低温中进行。此外也可用葡萄糖凝胶G-25或G-50过柱的办法除盐，所用的时间就比较短。

2、等电点沉淀法

蛋白质在静电状态时颗粒之间的静电斥力最小，因而溶解度也最小，各种蛋白质的等电点有差别，可利用调节溶液的pH达到某一蛋白质的等电点使之沉淀，但此法很少单独使用，可与盐析法结合用。

3、低温有机溶剂沉淀法

用与水可混溶的有机溶剂，甲醇，乙醇或丙酮，可使多数蛋白质溶解度降低并析出，此法分辨力比盐析高，但蛋白质较易变性，应在低温下进行。

（二）根据蛋白质分子大小的差别的分离方法

1、透析与超滤

透析法是利用半透膜将分子大小不同的蛋白质分开。

超滤法是利用高压力或离心力，强使水和其他小的溶质分子通过半透膜，而蛋白质留在膜上，可选择不同孔径的泸膜截留不同分子量的蛋白质。

2、凝胶过滤法

也称分子排阻层析或分子筛层析，这是根据分子大小分离蛋白质混合物最有效的方法之一。柱中最常用的填充材料是葡萄糖凝胶（Sephadex

ged）和琼脂糖凝胶（agarose gel）。

（三）根据蛋白质带电性质进行分离

蛋白质在不同pH环境中带电性质和电荷数量不同，可将其分开。

1、电泳法

各种蛋白质在同一pH条件下，因分子量和电荷数量不同而在电场中的迁移率不同而得以分开。值得重视的是等电聚焦电泳，这是利用一种两性电解质作为载体，电泳时两性电解质形成一个由正极到负极逐渐增加的pH梯度，当带一定电荷的蛋白质在其中泳动时，到达各自等电点的pH位置就停止，此法可用于分析和制备各种蛋白质。

2、离子交换层析法

离子交换剂有阳离子交换剂（如：羧甲基纤维素；CM-纤维素）和阴离子交换剂（二乙氨基乙基纤维素；DEAEFONT

FACE="宋体"

LANG="ZH-CN">纤维素），当被分离的蛋白质溶液流经离子交换层析柱时，带有与离子交换剂相反电荷的蛋白质被吸附在离子交换剂上，随后用改变pH或离子强度办法将吸附的蛋白质洗脱下来。（详见层析技术章）

（四）根据配体特异性的分离方法－亲和色谱法

亲和层析法（aflinity

chromatography）是分离蛋白质的一种极为有效的方法，它经常只需经过一步处理即可使某种待提纯的蛋白质从很复杂的蛋白质混合物中分离出来，而且纯度很高。这种方法是根据某些蛋白质与另一种称为配体(Ligand）的分子能特异而非共价地结合。其基本原理：蛋白质在组织或细胞中是以复杂的混合物形式存在，每种类型的细胞都含有上千种不同的蛋白质，因此蛋白质的分离（Separation），提纯（Purification）

和鉴定（Characterization）是生物化学中的重要的一部分，至今还没的单独或一套现成的方法能移把任何一种蛋白质从复杂的混合蛋白质中提取出来，因此往往采取几种方法联合使用。

细胞的破碎

1、高速组织捣碎：将材料配成稀糊状液，放置于筒内约1/3体积，盖紧筒盖，将调速器先拨至最慢处，开动开关后，逐步加速至所需速度。此法适用于动物内脏组织、植物肉质种子等。

2、玻璃匀浆器匀浆：先将剪碎的组织置于管中，再套入研杆来回研磨，上下移动，即可将细胞研碎，此法细胞破碎程度比高速组织捣碎机为高，适用于量少和动物脏器组织。

3、超声波处理法：用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞急剧震荡破裂，此法多适用于微生物材料，用大肠杆菌制备各种酶，常选用50-100毫克菌体/毫升浓度，在1KG至10KG频率下处理10-15分钟，此法的缺点是在处理过程会产生大量的热，应采取相应降温措施。对超声波敏感和核酸应慎用。

4、反复冻融法：将细胞在-20度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。

5、化学处理法：有些动物细胞，例如肿瘤细胞可采用十二烷基磺酸钠（SDS）、去氧胆酸钠等细胞膜破坏，细菌细胞壁较厚，可采用溶菌酶处理效果更好。

无论用哪一种方法破碎组织细胞，都会使细胞内蛋白质或核酸水解酶释放到溶液中，使大分子生物降解，导致天然物质量的减少，加入二异丙基氟磷酸（DFP）可以抑制或减慢自溶作用；加入碘乙酸可以抑制那些活性中心需要有疏基的蛋白水解酶的活性，加入苯甲磺酰氟化物（PMSF）也能清除蛋白水解酥活力，但不是全部，还可通过选择pH、温度或离子强度等，使这些条件都要适合于目的物质的提取。

浓缩、干燥及保存

一、样品的浓缩

生物大分子在制备过程中由于过柱纯化而样品变得很稀，为了保存和鉴定的目的，往往需要进行浓缩。常用的浓缩方法的：

1、减压加温蒸发浓缩

通过降低液面压力使液体沸点降低，减压的真空度愈高，液体沸点降得愈低，蒸发愈快，此法适用于一些不耐热的生物大分子的浓缩。

2、空气流动蒸发浓缩

空气的流动可使液体加速蒸发,铺成薄层的溶液，表面不断通过空气流；或将生物大分子溶液装入透析袋内置于冷室，用电扇对准吹风，使透过膜外的溶剂不沁蒸发，而达到浓缩目的，此法浓缩速度慢，不适于大量溶液的浓缩。

3、冰冻法

生物大分子在低温结成冰，盐类及生物大分子不进入冰内而留在液相中，操作时先将待浓缩的溶液冷却使之变成固体，然后缓慢地融解，利用溶剂与溶质融点介点的差别而达到除去大部分溶剂的目的。如蛋白质和酶的盐溶液用此法浓缩时，不含蛋白质和酶的纯冰结晶浮于液面，蛋白质和酶则集中于下层溶液中，移去上层冰块，可得蛋白质和酶的浓缩液。

4、吸收法

通过吸收剂直接收除去溶液中溶液分子使之浓缩。所用的吸收剂必需与溶液不起化学反应，对生物大分子不吸附，易与溶液分开。常用的吸收剂有聚乙二醇，聚乙稀吡咯酮、蔗糖和凝胶等，使用聚乙二醇吸收剂时，先将生物大分子溶液装入半透膜的袋里，外加聚乙二醇复盖置于4度下，袋内溶剂渗出即被聚乙二醇迅速吸去，聚乙二醇被水饱和后要更换新的直至达到所需要的体积。

5、超滤法

超滤法是使用一种特别的薄膜对溶液中各种溶质分子进行选择性过滤的方法，不液体在一定压力下（氮气压或真空泵压）通过膜时，溶剂和小分子透过，大分子受阻保留，这是近年来发展起来的新方法，最适于生物大分子尤其是蛋白质和酶的浓缩或脱盐，并具有成本低，操作方便，条件温和，能较好地保持生物大分子的活性，回收率高等优点。应用超滤法关键在于膜的选择，不同类型和规格的膜，水的流速，分子量截止值（即大体上能被膜保留分子最小分子量值）等参数均不同，必须根据工作需要来选用。另外，超滤装置形式，溶质成份及性质、溶液浓度等都对超滤效果的一定影响。Diaflo

超滤膜的分子量截留值：

膜名称分子量截留值孔的大的平均直径

XM－300300，000140

XM－200100，00055

XM－5050，00030

PM－30 30，00022

UM－2020，00018

PM－1010，00015

UM－21，00012

UM05500 10

用上面的超滤膜制成空心的纤维管，将很多根这样的管拢成一束，管的两端与低离子强度的缓冲液相连，使缓冲液不断地在管中流动。然后将纤维管浸入待透析的蛋白质溶液中。当缓冲液流过纤维管时，则小分子很易透过膜而扩散，大分子则不能。这就是纤维过滤秀析法，由于透析面积增大，因而使透析时间缩短10倍。

焦油脱盐主要方法有：1)在回收鼓风冷凝工段采取循环氨水和冷凝氨水混合的工艺流程，降低固定铵盐的浓度;2)采用焦油洗萘流程的粗苯工段，由于焦油中大量铵盐进入终冷循环水中，可降低焦油中的含盐浓度;3)焦油在进入管式炉前加入碳酸钠，使固定铵盐转化为不易分解的钠盐。例如：NH4CL+Na2CO3 NaCL+NH3+CO2+H2O 2NH4CL+Na2CO3 (NH4)2CO3+2NaCL

一种用于脱盐的化学剂

实验十九 血清γ--球蛋白的提取及鉴定

[原理]

用CAME可将血清蛋白分为清蛋白、α1、α2、β、γ球蛋白五个组分。其中γ--球蛋白是一类结构及功能相似的蛋白质，这些蛋白质都具有免疫功能，对机体起防卫作用，是免疫球蛋白的主要部分。

γ--球蛋白分子由四个亚基组成；大多数γ--球蛋白的分子量为

150 000左右， pI在6．3－7．3范围；血清中γ--球蛋白的含量为 7－ 15g／L（即 700－ 1500mg/dl）。

用盐析法沉淀血清蛋白质时，γ--球蛋白在（NH4）2SO4达到33％饱和度时即可首先沉淀下来而与其他血清蛋白分离。若使用层析法进一步纯化，即可得到纯度较高的γ--球蛋白。这是许多抗体提取的基本方法。

操作

l．盐析法提取γ--球蛋白

（ l）盐析：在大塑料离心管内加入猪（或人）血清 6ml， PBS（0． 1mol/L， PH7． 4）6ml，混匀。再逐滴加入6ml饱和硫酸铵溶液，边加边摇匀。静置30分钟。离心（3 000r／min， 10分钟）取沉淀。

（2）再盐析：将上述沉淀用 3ml PBS溶解后，逐滴加入饱和硫酸铵2ml，边加边摇匀。移至小离心管（或小试管）中，静置半小时，离心（3 000r／min，15分钟），留取沉淀。用 lml蒸馏水溶解沉淀物制成初步纯化的γ--球蛋白。

2．用SepadexG－25脱盐

（l） SepadexG－25的预处理：称取干胶3g置于 100ml烧杯中，加 60ml蒸馏水。煮沸 1时（注意切勿煮干）。室温冷却后倾去上清液；再加入 PBS 20ml，搅匀。

(2）装柱：将经预处理的 SepadexG－ 25装人 10cm x 20cm的层析柱待用。凝胶柱表面应在层析柱上口以下约4－5cm。

（3）上样：用经盐析取得的初步纯化的γ--球蛋白液 lml上样。方法：打开层析柱下夹，让凝胶表面的液体正好流完，关闭下夹。用滴管将样品沿管壁加在凝胶表面，打开下夹，使样品缓慢地全部进入凝胶柱内。用l－2mlPBS轻轻冲洗柱壁，并使其缓缓流入凝胶柱内，关闭下夹。在凝胶柱表面加入少量PBS，使液柱高2－3cm。

(4)洗脱及收集（图8一1）：打开下夹，在上口源源不断加入PBS进行洗脱。大分子γ--球蛋白先被洗脱流出，小分子(NH4)2SO4最后被洗脱流出。洗脱速度不应大于lml/min。对流出液进行分部收集（用部分收集器或用人工方法收集于小试管中），20ml/管。收集若干管（若部分收集器带有紫外监测仪，应收集到 A280＜ 0．01＝收集完毕，用20－30ml PBS缓冲液冲洗胶柱。未待凝胶柱表面PBS流尽，即关闭下夹。

（5）收集液检查：将各管收集液各一滴，滴于白瓷反应板的二个孔内。一孔用于检查NH4+，另一孔用于检查蛋白质。

检NH4+孔：加入一滴纳氏试剂。有N H4+者产生棕红色沉淀。

检蛋白孔：加入一滴双缩脲试剂。有蛋白者产生紫色。

（6）汇总收集液：将蛋白含量高而基本无NH4+的各管收集液汇集于大试管中，并量其体积。含蛋白的收集液为白色浑浊状。

3．浓缩 向蛋白收集液中按0．2g／ml加入SepadexG－25干胶（G－50用量可减至0．10g／ml），振摇5分钟后用 3 000r／min离心 5分钟，取上清液。

此浓缩过程具有进一步脱盐的作用。

4．DEAE纤维素柱层析——进一步纯化

(1) DEAE纤维素的预处理、平衡及装柱：请参阅实验十四。柱大小约为 1．5cm x40cm（容积约70ml）。

(2)加样：上述浓缩的γ--球蛋白收集液除留下5滴待电泳检测外，其余全部用于加样，方法同脱盐。

（3）梯度洗脱及分管收集（图8－2）：用0．01mol/L Na2HPO4（pH8）及05mol/LNaH2PO4（pH4）各80ml进行梯度洗脱（离子强度逐步升高； pH逐步下降）。用部分收集器分部收集： 0．5ml／min、4ml/管。共收集约40管。

5．浓缩汇总第一蛋白高峰的各管并进行浓缩。方法同步骤3。

6．脱盐方法同前，收集含蛋白部分。

7．浓缩方法同前，浓缩液中含纯度较高的γ--球蛋白。

注：DEAE－C柱层析收集液中含盐较少，已浓缩过程已部分脱盐，故时间不充裕时可免去6，7两步。

8．CAME检测取三张醋酸纤维薄膜，分别以原血清、操作3的浓缩液、操作5（或操作7）的浓缩液点样。电泳方法同实验四。用PAGE检测，分辨率更高。

9．结果判断提取物的电泳图谱上只有γ--球蛋白区带。

试剂

1．血清（人、兔、猪的无溶血血清）。

2．0．0lmol/L磷酸盐缓冲液（PBS），pH7．4。

3． 0．01mol／L Na2HPO4（pH8）。

4． 0．5mol/L NaH2PO4（pH4）。

5• SepadexG－ 25

6．奈氏（Nessler）试剂。

7．双缩脲试剂（见实验三）。

8．电泳试剂同实验四。

9．饱和硫酸铵溶液。

仪器

层析柱、部分收集器、白瓷反应板、紫外分光光度计（或紫外监测仪）、电泳设备。

常用的是凝胶过滤层析脱盐，利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，根据被分离物质的分子大小不同来进行分离。

蛋白质溶液中盐分子和蛋白质分子大小相差较大，盐分子较小，会随着层析流动相进入孔径较小的固定相，在层析中迁移速率小，而蛋白质分子尺寸较大，不能随流动相进入固定相，迁移速率大，首先从层析术中流出，实现脱盐。

扩展资料

盐析作用的实质是高浓度的强电解质破坏蛋白质分子表面的水化膜，同时电解质离子中和了蛋白质所带的电荷，蛋白质的稳定因素被消除，使蛋白质分子相互碰撞而凝聚沉淀。

蛋白质在水溶液中的溶解度取决于蛋白质分子表面离子周围的水分子数目，亦即主要是由蛋白质分子外周亲水基团与水形成水化膜的程度以及蛋白质分子带有电荷的情况决定的。

蛋白质溶液中加入中性盐后，由于中性盐与水分子的亲和力大于蛋白质，致使蛋白质分子周围的水化层减弱乃至消失。

同时，中性盐加入蛋白质溶液后由于离子强度发生改变，蛋白质表面的电荷大量被中和，更加导致蛋白质溶解度降低，之蛋白质分子之间聚集而沉淀。

由于各种蛋白质在不同盐浓度中的溶解度不同，不同饱和度的盐溶液沉淀的蛋白质不同，从而使之从其他蛋白中分离出来。简单的说就是将硫酸铵、硫化钠或氯化钠等加入蛋白质溶液，使蛋白质表面电荷被中和以及水化膜被破坏，导致蛋白质在水溶液中的稳定性因素去除而沉淀。

--脱盐比

--凝胶过滤层析

　　脱盐水（desalted water）是将所含易于除去的强电解质除去或减少到一定程度的水。脱盐水中的剩余含盐量应在1～5 毫克/升之间。

　　制取脱盐水的方法主要有以下三种：

　　①蒸馏法，使含盐的水加热蒸发，将蒸气冷凝即得脱盐水；

　　②离子交换法，使含盐的水通过装有泡沸石或离子交换剂的交换柱（见离子交换），钙、镁等离子留在交换柱上，滤过的水为脱盐水；

　　③电渗析法，借离子交换膜对离子的选择透过性，在外加电场作用下，使两种离子交换膜之间的水中的阳、阴离子，分别通过交换膜向阴、阳两极集中。于是膜间区成为淡水区，膜外为浓水区。从淡水区引出的水即为脱盐水。

　　蒸馏法多用于实验室用来洗刷容器或制备溶液，适用于量不多纯度要求较高场所。离子交换法与电渗析法多用于化工业如锅炉用水可以减少结垢和腐蚀，适用于量大纯度要求不是很高的场所。